益生菌对活动期溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织及IFN-γ、IL-12表达的影响

益生菌对活动期溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织及IFN-γ、IL-12表达的影响*

**通信作者 E-mail:007yl@sina.com

网络出版时间：2015-10-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20151013.1309.066.html

王岩， 杨立**, 刘威羽

(辽宁省人民医院 消化内科， 辽宁 沈阳110016)

[摘要]目的： 探讨益生菌VSL#3对三硝基苯磺酸钠(TNBS)诱导的活动期溃疡性结肠炎(UC)大鼠肠道功能及干扰素(IFN)-γ、白介素12(IL-12)表达的影响。方法: 21只8周龄SD大鼠，均分为对照组(A组)、TNBS模型组(B组)及VSL#3治疗组(C组)，A组给予0.25 mL生理盐水灌肠，B、C组给予100 g/L TNBS 0.25 mL灌肠建立UC大鼠模型；造模第2天A、B组给予生理盐水0.25 mL灌胃，C组给予VSL#3溶液0.25 mL灌胃；第8天时处死大鼠，比较各组大鼠结肠黏膜组织形态、病理学评分、疾病活动指数(DAI)评分、髓过氧化物酶(MPO)活性变化和IFN-γ、IL-12免疫阳性细胞的表达。结果： A组肠组织未见溃疡病灶，B组肠组织可见溃疡，充血水肿程度较重，与B组比较，C组较B组溃疡减少、缩小、并有修复；光镜下A组无明显炎症细胞浸润，B组可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，黏膜下急性小血管炎症出血和纤维素样坏死，而C组较B组炎性细胞浸润减少；DAI、病理学评分C组较B组均明显下降(P<0.01)，MPO活性低于B组而高于A组(P<0.05)；B组IFN-γ和IL-12明显高于A组，C组较B组有降低，但仍明显高于A组(P<0.05)；UC模型大鼠肠组织IFN-γ与IL-12的IOD值呈显著正相关(r=0.964 0，P<0.01)，UC模型大鼠肠组织IFN-γ、IL-12的IOD值与肠组织病理学评分、MPO活性及DAI呈正相关(r=0.875 0、0.881 0及0.767 1，P<0.05；r=0.837 0、0.850 8及0.713 3， P<0.05)。结论： VSL#3辅助治疗对TNBS诱导的UC大鼠有确切疗效，其作用机制可能与益生菌VSL#3通过有效抑制大鼠结肠黏膜 IFN-γ、IL-12 的表达有关。

[关键词]结肠炎,溃疡性； 益生菌VSL#3； 干扰素γ； 白细胞介素12; 基因表达； 大鼠，Sprague Dawley

[基金项目]*辽宁省自然科学

[中图分类号]R574.62[文献标识码]A

Effect of Probiotic Bacteria on Colonic Mucosa Tissue and the Expression

of IFN-γ and IL-12 in Rats with Ulcerative Colitis

WANG Yan， YANG Li， LIU Weiyu

(DepartmentofGastroenterology，People'sHospitalofLiaoningProvince，Shenyang110016,Liaoning,China)

Abstract[]Objective: To investigate the effect of probiotic VSL#3 on function and inflammatory cytokines of rats with active phase of ulcerative colitis induced by TNBS. Methods: Twenty-one adult SD rats were randomly divided into normal control group (group A)，TNBS group (group B)，VSL#3 treatment group (group C), 7 in each group. Group A received enema of 0.25 mL dose of normal saline while Group B and Group C received enema of 0.25 mL of TNBS (100 g/L concentration) to construct UC rats model. After 2 days of model-building, group A and group B received intragastric administration of 0.25 mL dose of normal saline while group C received intragastric administration of 0.25 mL dose of VSL#3 solution. At 8th day, rats were killed. Morphologic changes of colonic mucosa tissue，pathology score, MPO activity and expression of IFN-γ，IL-12 immune positive cells were compared between group A, group B and group C. Results: There was no ulcer lesion in colonic mucosa tissue in group A while there was ulcer lesion in colonic mucosa tissue in group B, and the degree of congestion and edema was severe. Compared with group B, ulcer in group C decreased, shrank and repaired itself to some extent. Under light microscope, there existed no obvious inflammatory cell infiltration in group A while in group B there was a lot of infiltration of neutrophile granulocyte and leukomonocyte, and acute inflammation of small blood vessels and fibrinoid necrosis under mucous membrane. Compared with group B, in group C inflammatory cell infiltration decreased, pathology score decreased significantly (P<0.01), MPO activity decreased but higher than that of group A (P<0.05). IFN-γ and IL-12 expression levels in group B were significantly higher than those of group A while in group C these indexes decreased but still higher than those of group A. There were statistical significance in the differences between group A and group B, between group B and group C, and between group A and group C (P<0.05). The IOD value of IFN-γ in UC model rats were positively correlated with IOD value of IL-12 (r=0.964 0，P<0.01). The IOD value of IFN-γ and IOD value of IL-12 in UC model rats were positively correlated with pathology score, MPO activity and DAI(r=0.875 0,0.881 0 and 0.767 1，P<0.05；r=0.837 0,0.850 8 and 0.713 3，P<0.05). Conclusion: VSL#3 has adjuvant treatment effects in rats induced by TNBS, whose mechanism may be related to its inhibition of expression of IFN-γand IL-12 in rat colonic mucosa.

[Key words]colitis, ulcerative; probiotics VSL#3; interferon-γ; interleukin-12; gene expression; rats, Sprague-Dawley

人类肠道内细菌影响肠道黏膜免疫系统功能，可诱发遗传易感个体肠道发生免疫炎性反应，导致溃疡性结肠炎(UC)的发生。随着我国社会经济水平的不断提高和人群饮食习惯的改变，UC的发病率不断上升。研究提示，UC的发生与免疫、遗传和环境等多种因素相互作用有关，其中免疫功能异常、肠道菌群紊乱及遗传敏感性因子是主要因素[1]。肠道菌群紊乱是诱发溃疡性结肠炎的重要原因之一，益生菌的补充在临床治疗中显得尤为重要。本研究观察益生菌VSL#3对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导模型UC大鼠的疗效，通过检测炎性因子干扰素(Interferon)-γ和白介素(Interleukin)-12的表达变化，为应用益生菌治疗UC提供依据。

1材料与方法

1.1　动物、试剂及仪器

8周龄左右SD(Sprague Dawley,SD)雄性大鼠21只，体质量180～220 g，所有大鼠实验前适应环境1周。VSL#3由美国Ferring Pharmaceuticals公司生产，冻干活性混合益生菌，每袋2.5 g(含4 500亿细菌)，TNBS(Sigma公司，浓度5%，W/V)，IFN-γ、IL-12抗体(美国Santa Cruz生物技术有限公司)，髓过氧化物酶(MPO，南京建成生物工程研究所)。

1.2　方法

1.2.1UC大鼠造模建立21只8周龄SD大鼠，均分为对照组(A组)、TNBS模型组(B组)及VSL#3治疗组(C组)。B、C组按照参考文献[2]建立TNBS诱导的UC大鼠模型，大鼠先禁食24 h，并排空大便，乙醚麻醉大鼠后，将25 mg TNBS溶解于0.25 mL的50%乙醇中，用直径2 mm的无菌聚乙烯管插入大鼠肛门内约8 cm处进行灌肠，保持肛门高位30 s，A组则给予0.25 mL灌肠生理盐水灌肠，大鼠清醒后正常喂养。造模第2天开始A、B组大鼠给予生理盐水0.25 mL灌胃，C组给予VSL#3(含120 mg VSL#3)溶液0.25 mL灌胃，连续 7 d。

1.2.2标本采集及处理第8天时，3组实验大鼠给予水合氯醛腹腔内注射麻醉后处死。用预冷生理盐水将大肠洗净，于结肠末端距离肛门1 cm处剪取0.5 cm2结肠组织，用0.4%多聚甲醛浸泡、石蜡包埋、切片，染色，并进一步行免疫组织化学染色。其余标本-70 ℃冰箱保存备用。

1.2.3结肠炎病理学评分和疾病活动指数(DAI)评分参照文献[3]方法，进行结肠炎病理学评分。参照文献[4]方法，在光镜下观察结肠黏膜炎症程度、病变深度、隐窝破坏情况及病变范围。

1.2.4结肠组织IFN-γ、IL-12表达采用免疫组织化学法，取石蜡切片常规脱蜡至水，抗原热修复，3%过氧化氢孵育15 min，滴加5%正常山羊血清室温封闭15 min，倾去血清，勿洗；滴加一抗IFN-γ、IL-12(分别用PBS作1∶50稀释)至完全覆盖组织，4 ℃湿盒过夜；再滴加二抗(用PBS稀释200倍的生物素化驴抗山羊Ig G)，37 ℃湿盒内孵育30 min，滴加辣根酶标记链酶亲合素，37 ℃温育30 min，DAB显色40 s，苏木素复染3 min后自来水冲洗，常规脱水透明，封片。IFN-γ阳性表达细胞的胞核和胞质都有着色，以胞核为主，阳性着色细胞主要为黏膜固有层淋巴细胞，还有单核细胞，肠上皮细胞也有少量着色。IL-12阳性表达细胞表现以胞质呈棕褐色为主，胞核也有少量着色阳性表达细胞主要有淋巴细胞，中性粒细胞单个核细胞也有少量表达，多集中于黏膜固有层内，肠上皮细胞仅有少量阳性表达。免疫组化图IOD值检测应用Image-pro plus 6.0软件。

1.2.5MPO测定 取-70 ℃保存的结肠组织，根据组织量加入0.9% NaCl 2 mL制成组织匀浆液，4 ℃ 3 000 r/min离心20 min，取上清液备用。按MPO ELISA试剂盒说明操作，于450 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度(A)值。依据计算公式得到MPO值。

1.3　统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　病理学、DAI评分和MPO活性

肉眼观察A组肠组织黏膜上皮完整，腺体排列整齐，未见溃疡病灶。B组肠组织肠壁明显坏死变薄并可见溃疡，充血水肿程度较重。与B组比较，C组可见不同程度的炎症消散，充血水肿程度减轻，溃疡减少，缩小修复。光镜下A组肠黏膜腺体规则，可见大量胞质富含黏液的杯状细胞，无明显炎症细胞浸润。B组可见肠黏膜腺体破坏，隐窝变形，隐窝脓肿形成，杯状细胞分泌减少，大量中性粒细胞淋巴细胞浸润，黏膜下急性小血管炎症出血和纤维素样坏死。而C组与B组相比，炎性细胞浸润减少，隐窝变形恢复和杯状细胞分泌增多。DAI评分病理学评分及MPO活性比较，C组较B组均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；B组大鼠肠组织MPO活性与A组相比，含量显着上升，C组MPO活性低于B组而高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2　IFN-γ、IL-12表达水平与UC模型大鼠相关性

IFN-γ和IL-12在A组肠组织仅见微弱的表达，而B组明显高于A组，C组较B组有降低，但仍明显高于A组，A、B及C组两两比较，差异有统计学意义(P<0.05。见图1、表1。UC模型大鼠肠组织IFN-γ与IL-12的IOD值呈显著正相关(r=0.964 0，P<0.01)。

表1　TNBS 诱导的各组大鼠结肠组织DAI评分、

2.3　UC模型大鼠肠组织IFN-γ、IL-12的IOD值与DAI及MPO活性相关性

UC模型大鼠肠组织IFN-γ、IL-12的IOD值与肠组织病理学评分、MPO活性和DAI呈正相关(r=0.875 0、0.881 0及0.767 1，P<0.05；r=0.837 0、0.850 8及0.713 3，P<0.05)。

3讨论

多项研究表明溃疡性结肠炎患者肠道微生态平衡被打破，厌氧菌数量明显增加，益生菌数量显著减少，潜在致病菌增加。普遍认为肠道细菌在UC的发病机制中起重要作用，可能是参与UC致病的始动和持续因素。研究证明溃疡性结肠炎患者存在肠道菌群失调[5-7]。已由免疫缺陷UC模型证实，在肠道无菌环境下不发生肠道炎性反应，但在恢复正常肠道菌群状态时则出现肠道炎性反应[8]。

微生态制剂主要包括益生菌(probiotics)和益生元(prebiotics)。益生菌是指乳杆菌、双歧杆菌、乳酸菌等有益于肠道健康的细菌。益生菌可直接或间接作用于肠黏膜上皮而发挥作用，改善肠道菌群，使其恢复正常的肠道微生态平衡，同时增强肠黏膜屏障功能，调节肠道免疫系统功能，最终起到防治UC的作用[9-10]。本文研究观察到，与A组比较，B组大鼠结肠黏膜局部存在炎症反应和组织损伤。而治疗用药后第2天，B组及C组大鼠均有腹泻，粘液脓血便，临床表现相似，DAI差异不明显。第3天起C组大鼠腹泻略有减轻，至第4天C组大鼠的腹泻，粘液脓血便明显好转，DAI显著低于B组(P<0.05)。病理学观察炎性细胞浸润减少，隐窝变形明显恢复，杯状细胞黏液增多，溃疡缩小修复。表明VSL#3对TNBS诱导的UC治疗有效。实验观察到B组较A组结肠黏膜IFN-γ、IL-12表达显著升高，提示IFN-γ、IL-12可能在UC的发病机制中起重要作用。IFN-γ和IL-12表达水平与肠道病理损害的大体形态和组织学评分指数及MPO活性呈显著性正相关。因此，IFN-γ和IL-12表达量可反映肠组织的病理损害程度，可用于对UC病情的评估及治疗效果的判断。而C组结肠黏膜IFN-γ、IL-12蛋白表达水平呈不同程度下降，表明益生菌可以有效降低IFN-γ、IL-12的表达，并提示VSL#3治疗UC的机制与降低IFN-γ、IL-12的表达有关。

A为正常对照组，B为模型组，C为VSL#3治疗组 图1　IFN-γ和IL-12在各组大鼠结肠中的表达 Fig.1　Expression of IFN-γand IL-12 in colon of rats

本研究提示益生菌的免疫调节作用表现在能降低UC炎症肠段组织中促炎性细胞因子的表达,可能是其作用的机制之一。但益生菌制剂的治疗效果还缺乏明确的循证医学证据，有待于进行多中心、大样本、随机、双盲、对照的临床试验。

4参考文献

[1]Kellermayer R.Epigenetics and the developmental origins of inflammatory bowel diseases[J].Can J Gastroenterol， 2012(12)：909-915.

[2]Morris GP，Beck PL，Herrridge MS，et al.Hapten-induced model of chorinic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology， 1989(3)：795-803.

[3]Dieleman LA，Palmen MJ，Akol H，et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium(DSS)is chatacterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol， 1998(3)：385-391.

[4]Hamamoto N，Maemura K，Hirata I，et al.Inhibition of dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis in mice by intracolonically administered antibodies against adhesion molecules(endothelial leucocyte adhesion molecule-1(ELAM-1)or intercellular adhension molecule-1(ICAM-1) [J].Clin Exp Immunol， 1998(3)：462-468.

[5]Wilson ID，Nicholson JK.The role of gut microbiota in drug response[J].Current pharmaceutical design， 2009(13)：1519-1523.

[6]Shen B.Acute and chronic pouchitis-pathogenesis，diagnosis and treatment[J].Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology， 2012(6)：323-333.

[7]McLaughlin SD，Walker AW，Churcher C，et al.The bacteriology of pouchitis：a molecular phylogenetic analysis using 16s rRNA gene cloning and sequencing[J].Annals of Surgery， 2010(1)：90-98.

[8]Cain AM，Karpa KD.Clinical utility of probiotics in inflammatory bowel disease[J].Altern Ther Health Med， 2011(1)：72-79.

[9]Noor SO，Ridgway K，Scovell L，et al.Ulcerative colitis and irritable bowel patients exhibit distinct abnormalities of the gut microbiota[J].BMC Gastroenterology， 2010(1)：134.

[10]江学良，崔慧斐.对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见的解析[J].世界华人消化杂志， 2008(11)：1141-1143.

(2015-07-28收稿，2015-09-08修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华