褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶抑制机理研究

2015-12-31 12:05易建华董新玲朱振宝赵雪萌
食品与机械 2015年4期
关键词:苹果汁褐变植酸

易建华 董新玲 朱振宝 赵雪萌

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西 西安 710021)

苹果汁是人们喜爱的果蔬汁之一,近年来,中国苹果汁的产量增加很快。在世界贸易中,浓缩苹果汁的贸易量逐年提高[1]。然而在加工和贮藏的过程中,苹果汁易发生褐变反应,由诱人的金黄色变成棕褐色,色值下降、感官品质劣变,营养价值降低[2]。果汁的褐变主要是由酶促褐变引起的,这一直是采后生理研究的重点。酶促褐变是在氧气参与条件下,果蔬中的多酚物质经PPO催化变色所致[3]。PPO是发生酶促褐变的主要酶,存在于大多数果蔬中。鉴于PPO对苹果汁品质的不利作用,果汁生产过程中常采用抑制剂抑制PPO的活性,从而达到控制褐变的目的,因此,研究褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶的抑制机理具有重要意义。

酶促褐变的发生需要3个条件,即适当的酚类底物、酚氧化酶和氧。在控制酶促褐变试验过程中,通过除去底物抑制褐变的可能性很小,有研究者[4]曾设想改变酚类底物的结构,但目前为止未取得成功。实践中控制酶促褐变的方法主要是添加抑制剂影响酶活性。根据抑制剂与酶的作用是否可逆,通常将抑制作用分为不可逆抑制和可逆抑制两类,可逆抑制作用除了竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制以外,还有混合型抑制剂,混合型抑制剂包括两种类型:非竞争性和反竞争性混合抑制,非竞争性和竞争性混合抑制[4]。

目前国内外已研究出多种褐变抑制剂,其中4-HR、谷胱甘肽、β-CD、有机钙盐、半胱氨酸和植物提取物等是研究较多的 新 型 褐 变 抑 制 剂。Alvarez-Parrilla等[5]发 现 β-CD 与4-HR有很好的协助作用,这两种抑制剂联合使用对PPO活力的抑制效果比单独使用要好,但具体的抑制机理目前尚不清楚。赵坚华等[6]研究抑制剂对苹果梨中多酚氧化酶的抑制作用表明,苹果梨中多酚氧化酶的最佳抑制剂是谷胱甘肽,可以有效抑制活力,当谷胱甘肽浓度为300μmol/L时,多酚氧化酶的活力降到50%,当浓度增大到500μmol/L时,多酚氧化酶完全失去活力。周会玲等[7]对不同品种苹果汁的褐变及其抑制方法的研究表明,对黄元帅苹果汁用0.32g/L的Vc、对乔纳金苹果汁用0.48g/L的Vc在榨汁时进行处理能较好地抑制褐变。然而有关常用抑制剂的机理没有做出系统的研究。

有研究[8-10]认为,绿原酸、儿茶素是PPO的良好褐变底物,是引起果实褐变的主要酚类物质。本研究拟以绿原酸缓冲液为苹果汁的模拟体系,测定不同浓度4-己基间苯二酚、草酸、植酸和苯甲酸对酶活的影响,通过对酶反应速率和底物浓度做Lineweaver-Burk双倒数图,对比4种抑制剂的抑制动力学,判定各抑制剂的抑制类型,为果汁褐变抑制剂的选择和使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

富士苹果:购于当地水果市场(每个样品尽量均匀一致);

绿原酸:纯度85%,西安楚康责任有限公司;

邻苯二酚、柠檬酸、磷酸氢二钠等:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;

对甲氧基苯甲酸:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

草酸:分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;

植酸:生化试剂,国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

九阳料理机:JYL-C020型,山东九阳股份有限公司;

高速低温离心机:CT15RT型,上海天美生化仪器设备工程有限公司;

精密酸度计:PB-10型,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;

电热恒温鼓风干燥箱:GZX-GF-101-3-5型,上海跃进医疗器械有限公司;

电子天平:BS323S型,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;

漩涡混合器:QL-901型,海门市其林贝儿仪器制造有限公司;

磁力搅拌器:JBZ-14H型,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;

紫外可见分光光度计:UV759S型,上海荆和分析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果PPO的提取 将低温下冷藏的新鲜苹果清洗、去皮、切成小块,称取150g果肉放入料理机中,立刻加入300mL含2%聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)pH 6.8的磷酸盐缓冲液(4℃预冷)进行榨汁。浊汁于4℃、12 000r/min离心30min,取上清液,加入500mL丙酮(4℃预冷),搅拌待沉淀产生,置于4℃、12 000r/min离心15min,取沉淀物,冷冻干燥,再加入含1%Tween-80的磷酸盐缓冲液,再次离心15min,得上清液,即为 PPO 粗酶液[11]。

将粗酶液加入到95%的(NH4)2SO4溶液中,在4℃下静置2h,然后于12 000r/min离心30min,将所得沉淀溶于10mL pH 6.50的磷酸缓冲液中,置于4℃透析24h,期间换透析液4次[12]。

1.2.2 苹果PPO活性测定 根据文献[13]。

1.2.3 抑制剂对PPO酶促反应的抑制作用 用pH 6.50的磷酸缓冲液分别配制不同浓度的4-HR(0.05,0.1,0.2,0.5mmol/L)和底物绿原酸(0.1,0.5,1,5,10mmol/L)溶液,于比色皿中加入0.3mL浓度为0.05mmol/L 4-HR,再加入0.3mL(纯化)PPO酶液(体系总酶活为10U),平衡10min后加入2.4mL浓度0.1mmol/L绿原酸溶液,并开始计时,于420nm下每隔15s测定吸光值A,连续测定3min。改变底物浓度和抑制剂浓度,测定不同浓度抑制剂对酶活力的影响,做3组平行试验。以酶促反应速率(每秒吸光值的变化)与底物浓度之间的动力学关系作图,研究酶促反应遵循米氏(Michaelis-Menten)动学方程,并做 Lineweaver-Burk双倒数图,判断抑制剂的抑制类型[14]。草酸、植酸和苯甲酸试验方法同上。

2 结果与分析

2.1 4-HR对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

4-HR对绿原酸模拟果汁酶促褐变的抑制作用及其机理见图1。由图1(a)可知,底物浓度一定时,酶促反应速率随4-HR浓度的增大而降低。从图1(b)可以看出,Lineweaver-Burk双倒数是一组纵轴截距不变的直线,即酶促反应最大速率(V)不变,但米氏常数(K)随着4-HR浓度增大而变大,说明4-HR是PPO的竞争性抑制剂。这与Alvarez-Parrilla等[5]的研究结果一致。

图1 4-HR对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 1 The inhibition of 4-HR on apple PPO

2.2 草酸对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

草酸对绿原酸模拟果汁酶促褐变的抑制作用及其机理见图2。由图2(a)可知,底物浓度一定时,随着草酸浓度的增大,酶促反应逐渐降低。由图2(b)可知,Vmax不变,Km随着抑制剂浓度的增大而增大,说明草酸对PPO的抑制能力表现为浓度依赖性,即浓度越大,抑制作用越强,对PPO的抑制属于竞争性抑制,宋连军等[15]研究表明草酸对PPO的抑制机理表现为不可逆效应,与本试验结果有所不同。而S.M.Son等[16]研究表明,不同儿茶素浓度下,酶促褐变速率随草酸浓度的增大而降低,抑制类型属于竞争性抑制,这与本试验结果一致。

图2 草酸对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 2 The inhibition of oxalic acid on apple PPO

2.3 植酸对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

植酸(肌醇六磷酸)是一种很强的抑制剂[12],具有12个羧基,能够通过与金属螯合作用来抑制多酚氧化酶的活性[17]。虽然有报道指出植酸对果蔬汁有护色效果,但目前关于植酸在苹果汁中的应用研究不深入,赵玉生等[18]研究表明,植酸及其盐天然无毒,是理想的植物性食品护色保鲜剂,应积极推广。

本试验研究植酸对模拟果汁酶促褐变的抑制作用及其机理见图3。由图3(a)可知,加入植酸后酶促反应速率明显降低,且随着植酸添加量的增加,酶促反应速率逐渐降低,该研究结果与宋连军等[19]的研究结果一致。由图3(b)可知,加入植酸后,酶促反应的Vmax增大,Km降低,不符合可逆抑制类型中的任一模式,可见,植酸对PPO的作用属于混合型抑制。

2.4 苯甲酸对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

图3 植酸对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 3 The inhibition of phytic acid on apple PPO

图4 苯甲酸对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 4 The inhibition of benzoic acid on apple PPO

苯甲酸对绿原酸模拟果汁体系褐变的抑制动力学见图4。由图4可知,酶促反应中加入苯甲酸后,最大反应速率Vmax变小,Km不变;不同浓度抑制剂的双倒数直线相交于横轴,纵轴截距因抑制剂的存在而变大,抑制分数与抑制剂浓度成正比,与底物浓度无关,说明苯甲酸是PPO的非竞争性抑制剂,这与黄晓丹等[20]研究结果一致,即苯甲酸能抑制蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶的活性,其效应为可逆抑制效应,苯甲酸对二酚酶的抑制作用表现为非竞争性抑制。

3 结论

4-HR、草酸、植酸和苯甲酸对PPO酶催化绿原酸模拟果汁体系褐变均有抑制作用。不同抑制剂对含绿原酸模拟果汁中PPO抑制机理不同。4-HR和草酸对PPO抑制作用为竞争性抑制,植酸为混合性抑制,苯甲酸酶为非竞争性抑制。本试验只对苹果中含量较多的绿原酸酶促褐变抑制机理进行研究,而苹果中多酚物质种类繁多,因此,抑制剂对其他主要酚类物质酶促褐变的抑制作用,还有待于进一步研究。

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