褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶抑制机理研究

易建华 董新玲 朱振宝 赵雪萌

（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安 710021）

苹果汁是人们喜爱的果蔬汁之一，近年来，中国苹果汁的产量增加很快。在世界贸易中，浓缩苹果汁的贸易量逐年提高［1］。然而在加工和贮藏的过程中，苹果汁易发生褐变反应，由诱人的金黄色变成棕褐色，色值下降、感官品质劣变，营养价值降低［2］。果汁的褐变主要是由酶促褐变引起的，这一直是采后生理研究的重点。酶促褐变是在氧气参与条件下，果蔬中的多酚物质经PPO催化变色所致［3］。PPO是发生酶促褐变的主要酶，存在于大多数果蔬中。鉴于PPO对苹果汁品质的不利作用，果汁生产过程中常采用抑制剂抑制PPO的活性，从而达到控制褐变的目的，因此，研究褐变抑制剂对苹果多酚氧化酶的抑制机理具有重要意义。

酶促褐变的发生需要3个条件，即适当的酚类底物、酚氧化酶和氧。在控制酶促褐变试验过程中，通过除去底物抑制褐变的可能性很小，有研究者［4］曾设想改变酚类底物的结构，但目前为止未取得成功。实践中控制酶促褐变的方法主要是添加抑制剂影响酶活性。根据抑制剂与酶的作用是否可逆，通常将抑制作用分为不可逆抑制和可逆抑制两类，可逆抑制作用除了竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制以外，还有混合型抑制剂，混合型抑制剂包括两种类型：非竞争性和反竞争性混合抑制，非竞争性和竞争性混合抑制［4］。

目前国内外已研究出多种褐变抑制剂，其中4－HR、谷胱甘肽、β－CD、有机钙盐、半胱氨酸和植物提取物等是研究较多的 新 型 褐 变 抑 制 剂。Alvarez－Parrilla等［5］发 现 β－CD 与4－HR有很好的协助作用，这两种抑制剂联合使用对PPO活力的抑制效果比单独使用要好，但具体的抑制机理目前尚不清楚。赵坚华等［6］研究抑制剂对苹果梨中多酚氧化酶的抑制作用表明，苹果梨中多酚氧化酶的最佳抑制剂是谷胱甘肽，可以有效抑制活力，当谷胱甘肽浓度为300μmol/L时，多酚氧化酶的活力降到50%，当浓度增大到500μmol/L时，多酚氧化酶完全失去活力。周会玲等［7］对不同品种苹果汁的褐变及其抑制方法的研究表明，对黄元帅苹果汁用0.32g/L的Vc、对乔纳金苹果汁用0.48g/L的Vc在榨汁时进行处理能较好地抑制褐变。然而有关常用抑制剂的机理没有做出系统的研究。

有研究［8－10］认为，绿原酸、儿茶素是PPO的良好褐变底物，是引起果实褐变的主要酚类物质。本研究拟以绿原酸缓冲液为苹果汁的模拟体系，测定不同浓度4－己基间苯二酚、草酸、植酸和苯甲酸对酶活的影响，通过对酶反应速率和底物浓度做Lineweaver－Burk双倒数图，对比4种抑制剂的抑制动力学，判定各抑制剂的抑制类型，为果汁褐变抑制剂的选择和使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

富士苹果：购于当地水果市场（每个样品尽量均匀一致）；

绿原酸：纯度85%，西安楚康责任有限公司；

邻苯二酚、柠檬酸、磷酸氢二钠等：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

对甲氧基苯甲酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

草酸：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；

植酸：生化试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

九阳料理机：JYL－C020型，山东九阳股份有限公司；

高速低温离心机：CT15RT型，上海天美生化仪器设备工程有限公司；

精密酸度计：PB－10型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：GZX－GF－101－3－5型，上海跃进医疗器械有限公司；

电子天平：BS323S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

漩涡混合器：QL－901型，海门市其林贝儿仪器制造有限公司；

磁力搅拌器：JBZ－14H型，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；

紫外可见分光光度计：UV759S型，上海荆和分析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果PPO的提取 将低温下冷藏的新鲜苹果清洗、去皮、切成小块，称取150g果肉放入料理机中，立刻加入300mL含2%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）pH 6.8的磷酸盐缓冲液（4℃预冷）进行榨汁。浊汁于4℃、12 000r/min离心30min，取上清液，加入500mL丙酮（4℃预冷），搅拌待沉淀产生，置于4℃、12 000r/min离心15min，取沉淀物，冷冻干燥，再加入含1%Tween－80的磷酸盐缓冲液，再次离心15min，得上清液，即为 PPO 粗酶液［11］。

将粗酶液加入到95%的（NH4）2SO4溶液中，在4℃下静置2h，然后于12 000r/min离心30min，将所得沉淀溶于10mL pH 6.50的磷酸缓冲液中，置于4℃透析24h，期间换透析液4次［12］。

1.2.2 苹果PPO活性测定 根据文献［13］。

1.2.3 抑制剂对PPO酶促反应的抑制作用 用pH 6.50的磷酸缓冲液分别配制不同浓度的4－HR（0.05，0.1，0.2，0.5mmol/L）和底物绿原酸（0.1，0.5，1，5，10mmol/L）溶液，于比色皿中加入0.3mL浓度为0.05mmol/L 4－HR，再加入0.3mL（纯化）PPO酶液（体系总酶活为10U），平衡10min后加入2.4mL浓度0.1mmol/L绿原酸溶液，并开始计时，于420nm下每隔15s测定吸光值A，连续测定3min。改变底物浓度和抑制剂浓度，测定不同浓度抑制剂对酶活力的影响，做3组平行试验。以酶促反应速率（每秒吸光值的变化）与底物浓度之间的动力学关系作图，研究酶促反应遵循米氏（Michaelis－Menten）动学方程，并做 Lineweaver－Burk双倒数图，判断抑制剂的抑制类型［14］。草酸、植酸和苯甲酸试验方法同上。

2 结果与分析

2.1 4－HR对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

4－HR对绿原酸模拟果汁酶促褐变的抑制作用及其机理见图1。由图1（a）可知，底物浓度一定时，酶促反应速率随4－HR浓度的增大而降低。从图1（b）可以看出，Lineweaver－Burk双倒数是一组纵轴截距不变的直线，即酶促反应最大速率（V）不变，但米氏常数（K）随着4－HR浓度增大而变大，说明4－HR是PPO的竞争性抑制剂。这与Alvarez－Parrilla等［5］的研究结果一致。

图1 4－HR对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 1 The inhibition of 4－HR on apple PPO

2.2 草酸对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

草酸对绿原酸模拟果汁酶促褐变的抑制作用及其机理见图2。由图2（a）可知，底物浓度一定时，随着草酸浓度的增大，酶促反应逐渐降低。由图2（b）可知，Vmax不变，Km随着抑制剂浓度的增大而增大，说明草酸对PPO的抑制能力表现为浓度依赖性，即浓度越大，抑制作用越强，对PPO的抑制属于竞争性抑制，宋连军等［15］研究表明草酸对PPO的抑制机理表现为不可逆效应，与本试验结果有所不同。而S.M.Son等［16］研究表明，不同儿茶素浓度下，酶促褐变速率随草酸浓度的增大而降低，抑制类型属于竞争性抑制，这与本试验结果一致。

图2 草酸对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 2 The inhibition of oxalic acid on apple PPO

2.3 植酸对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

植酸（肌醇六磷酸）是一种很强的抑制剂［12］，具有12个羧基，能够通过与金属螯合作用来抑制多酚氧化酶的活性［17］。虽然有报道指出植酸对果蔬汁有护色效果，但目前关于植酸在苹果汁中的应用研究不深入，赵玉生等［18］研究表明，植酸及其盐天然无毒，是理想的植物性食品护色保鲜剂，应积极推广。

本试验研究植酸对模拟果汁酶促褐变的抑制作用及其机理见图3。由图3（a）可知，加入植酸后酶促反应速率明显降低，且随着植酸添加量的增加，酶促反应速率逐渐降低，该研究结果与宋连军等［19］的研究结果一致。由图3（b）可知，加入植酸后，酶促反应的Vmax增大，Km降低，不符合可逆抑制类型中的任一模式，可见，植酸对PPO的作用属于混合型抑制。

2.4 苯甲酸对苹果汁模拟体系酶促褐变的抑制作用

图3 植酸对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 3 The inhibition of phytic acid on apple PPO

图4 苯甲酸对苹果汁模拟体系中PPO的抑制作用Figure 4 The inhibition of benzoic acid on apple PPO

苯甲酸对绿原酸模拟果汁体系褐变的抑制动力学见图4。由图4可知，酶促反应中加入苯甲酸后，最大反应速率Vmax变小，Km不变；不同浓度抑制剂的双倒数直线相交于横轴，纵轴截距因抑制剂的存在而变大，抑制分数与抑制剂浓度成正比，与底物浓度无关，说明苯甲酸是PPO的非竞争性抑制剂，这与黄晓丹等［20］研究结果一致，即苯甲酸能抑制蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶的活性，其效应为可逆抑制效应，苯甲酸对二酚酶的抑制作用表现为非竞争性抑制。

3 结论

4－HR、草酸、植酸和苯甲酸对PPO酶催化绿原酸模拟果汁体系褐变均有抑制作用。不同抑制剂对含绿原酸模拟果汁中PPO抑制机理不同。4－HR和草酸对PPO抑制作用为竞争性抑制，植酸为混合性抑制，苯甲酸酶为非竞争性抑制。本试验只对苹果中含量较多的绿原酸酶促褐变抑制机理进行研究，而苹果中多酚物质种类繁多，因此，抑制剂对其他主要酚类物质酶促褐变的抑制作用，还有待于进一步研究。

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