黑苏嘎－25对脑缺血再灌注损伤模型大鼠血清肿瘤坏死因子－α、白细胞介素－1β表达的影响

黑苏嘎-25对脑缺血再灌注损伤模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β表达的影响

佟淑平孙志刚杜闻博王洪军李立飞田小东丁海东

(内蒙古民族大学附属医院，内蒙古通辽028000)

摘要〔〕目的探讨黑苏嘎-25对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法取清洁级健康Wistar大鼠60只，分为假手术组、模型组、黑苏嘎-25低、中、高剂量组，用药组动物灌胃给药7 d，制备局灶性脑缺血再灌注(MCAO)大鼠模型，通过行为学判断神经功能缺损评分、组织病理学测定脑梗死面积、酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平。结果黑苏嘎-25能减少MCAO大鼠的神经功能缺损评分及脑梗死的面积，降低局灶性脑缺血后血清TNF-α、IL-1β水平。结论黑苏嘎-25对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其作用机制与降低血清TNF-α、IL-1β含量有关。

关键词〔〕蒙药；黑苏嘎-25；脑缺血再灌注损伤

中图分类号〔〕R74〔文献标识码〕A〔

基金项目：内蒙古民族大学研究项目(NMD1184)

通讯作者：杜闻博(1981-),男,硕士，主要从事脑血管病学研究。

第一作者：佟淑平(1978-),女，硕士，主要从事肺间质性疾病研究。

缺血性脑血管病(ICVD)的防治一直是神经病学的难点和重点〔1，2〕，目前治疗的关键是尽早溶栓治疗恢复缺血脑细胞、组织血液灌流，一方面可挽救濒临死亡的脑细胞，但另一方面也会加重脑细胞损伤，导致脑细胞死亡，也就是说缺血后的血流再灌注在某些情况下会进一步导致细胞、组织损伤和功能障碍，造成脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤(CIRI)是由于血流再灌注后引起的继发性损伤，是目前最受关注的问题之一〔3〕，越来越多学者研究关于CIRI机制中脑组织缺血后的炎症反应〔4〕。因此通过各种有效措施阻断肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的表达可减少缺血性神经元损伤〔5〕。蒙药黑苏嘎-25主治脉病、偏瘫、半身不遂等临床疗效显著，主要成分有石决明、麝香、牛黄、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、荜拨、肉桂、黑种子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，药理具有良好的抗脑缺血损伤作用。黑苏嘎-25成分是从天然产物中提取，具有副作用小且作用多途径、多靶点，可针对脑缺血性变化的多个环节。本文探讨黑苏嘎-25对实验性大鼠CIRI的保护作用及机制。

1材料与方法

1.1动物、主要药品、试剂及仪器选用健康雄性Wistar大鼠60只，体重约(230±20)g，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号码：SCXK(吉)-2011-0004。大鼠饲养于适宜温度及湿度的动物室中，处于相同饲养环境且自由摄食和饮水，自然昼夜(术前12 h禁食水)。黑苏嘎-25 (0.2 g/粒，内蒙古民族大学附属医院制剂室生产)；TNF-α试剂盒、IL-1β试剂盒(上海丽臣生物科技有限公司，美国进口分装)；红四氮唑(TTC)：天津市福晨化学试剂厂；水合氯醛：青岛宇龙海藻有限公司。手术显微镜(吉祥鸟牌，江苏镇江中文光学仪器有限责任公司)；全自动多功能酶标仪(MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬兰)；医用图像分析系统(BI-2000成都泰盟科技有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组60只健康雄性Wistar大鼠，随机分成五组，每组12只。假手术组：假手术+生理盐水灌胃；模型组：缺血再灌注+生理盐水灌胃； 治疗组高、中、低剂量黑苏嘎-25组：缺血再灌注+高、中、低剂量黑苏嘎-25灌胃。

1.2.2给药方法假手术组：生理盐水5 ml·kg-1·d-1；模型组：生理盐水5ml·kg-1·d-1；高、中、低剂量黑苏嘎-25组：360、180、90 mg·kg-1·d-1，溶于和假手术组等体积的生理盐水，用前摇匀。灌胃给药，每天1次，连续7 d。

1.2.3CIRI模型的制备模型组与用药组Wistar大鼠于最后1次灌胃后2 h参照Longa等〔6〕的改良的线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型：用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定，用医用碘伏消毒颈前部，在颈正中行长约2 cm切口，钝性分离，暴露左侧颈总动脉(CCA)和分叉部，分离分叉处的颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，分离ECA分支枕动脉、甲状腺上动脉，依次结扎CCA近心端、支枕动脉、甲状腺上动脉，并在远心端剪断枕动脉、甲状腺上动脉，在甲状腺上动脉分支之后结扎颈外动脉近心端和远心端，自中间剪断。拉直近心端剪断的ECA，使ECA与ICA处于同一直线上，微动脉夹暂时性夹闭ICA远心端，于ECA距CCA分叉5 mm处附近，在ECA剪一“V”口，将线栓向颈内动脉颅方向插入16～18 mm(线栓直径0.24 mm，头端0.30 mm)注意不要误入翼腭动脉，可感到阻力而无法向前推进时停止，将线栓固定在ECA上，缝合手术切口，栓线尾部伸出皮下1 cm左右便于拔栓线，缺血2 h后，外拉栓线0.5 cm，从而实现24 h再灌注。假手术组仅暴露左侧颈总动脉，其余不做任何处理。模型成功的标志是大鼠左眼出现Horner征；提尾时右前肢内收屈曲；爬行时向右侧倾倒或按顺时针方向转圈，不成功者予以剔除，并随机补充。

1.2.4标本的收集与处理假手术组在手术后2 h，其余各组模型制备成功后，再达到各自再灌注时间点24 h时，经10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，打开胸腔，腹主动脉取血5 ml后，依次用生理盐水、4%多聚甲醛各200 ml进行左心室灌流固定，至流液透明，断头取脑，行TTC染色，测定脑梗死体积。

1.2.5神经功能缺损评分参照Longa等〔6〕的5分制评分标准对麻醉苏醒后的大鼠进行神经功能缺损评分。造模成功的判定标准：以大鼠手术麻醉清醒后出现右侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。0分、4分或死亡剔除，再随机补充。

1.2.6脑梗死体积测定(TTC染色法)假手术组在术后2 h，其余各组在模型制备成功后，达到各再灌注时间点24 h时，每组大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射深度麻醉，腹主动脉取血5 ml后，依次用生理盐水、4%多聚甲醛各200 ml进行左心室灌流固定，至流液透明，迅速断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，其余用排刀冠状切成8片，每片厚度约2 mm，置于2%TTC溶液中，37℃电热恒温培养箱避光染色30 min，4%多聚甲醛液中固定24 h后数码相机照片后，用医用图像分析系统(BI-2000成都泰盟科技有限公司)处理照片，测量脑梗死面积，计算脑梗死体积比，其与全脑体积之比为梗死体积百分比。

1.2.7血清TNF-α、IL-1β水平的表达假手术组在术后2 h，其余各组在模型制备成功后，达到各再灌注时间点24 h时，每组大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射深度麻醉，腹主动脉取血5 ml，在4℃冰箱内沉淀24 h后，3 000 r/min离心10 min留取上清液，-80℃低温冰箱保存备用。根据试剂盒说明书用ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平。

1.3统计学处理采用SPSS11.0软件进行Wilcoxon秩和检验法及单因素方差分析。

2结果

2.1脑缺血再灌注后神经功能缺损评分脑缺血2 h，再灌注24 h后，大鼠神经功能缺损症状主要表现为提尾时右前肢内屈曲收，肌力、肌张力降低，侧推阻力降低，活动减少，向右侧追尾转圈，伴或不伴有左侧Horner征。假手术组无神经功能缺损症状，评分均为0分；与假手术组相比，模型组及黑苏嘎-25治疗组均有明显的神经功能缺损症状(P<0.05)；与模型组相比，黑苏嘎-25低、中、高剂量组神经功能缺损程度均有所减轻，并随着药物剂量的增加，神经功能缺损评分减少，以黑苏嘎-25高剂量最为明显(P<0.05)。见表1。

2.2黑苏嘎-25对大鼠CIRI脑梗死体积的影响假手术组脑组织呈均匀红色无梗死灶；模型组和黑苏嘎-25组可见梗死苍白区域位右侧额顶叶皮质下部和纹状体外侧区。与假手术组相比，模型组及黑苏嘎-25高、中、低剂量组均有明显的白色梗死灶(P<0.05)；与模型组相比，黑苏嘎-25各剂量均使梗死灶体积减小，以黑苏嘎-25高剂量最为明显(P<0.05)。见表1。

2.3黑苏嘎-25对大鼠CIRI血清TNF-α水平的影响与假手术组相比，模型组及黑苏嘎-25各剂量组血清TNF-α水平的表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，黑苏嘎-25各剂量组均使血清TNF-α水平降低，以黑苏嘎-25高剂量最为明显(P<0.05)。见表2。

2.4黑苏嘎-25对大鼠CIRI损伤血清中IL-1β的影响与假手术组相比，模型组及黑苏嘎-25各剂量组血清中IL-1β水平的表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，黑苏嘎-25各剂量均使血清中IL-1β水平的表达降低，以黑苏嘎-25高剂量最为明显(P<0.05)。见表2。

表1　脑缺血再灌注后神经功能缺损评分及

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

表2　脑缺血再灌注后血清TNF-α、IL-1β水平的

3讨论

溶栓、抗血小板和抗凝治疗后，在血流复通实施再灌注的同时，又会在某些情况下(如炎症反应)加重已缺血细胞、组织的进一步损伤〔7〕。通过药物干预等方法减轻这种损伤程度，可达到较为理想的治疗目的。本实验研究结果显示，模型组在缺血2 h，再灌注24 h后，形成了再灌注损伤，表现为出现神经功能缺损症状，脑组织出现梗死灶及血清TNF-α、IL-1β水平升高；黑苏嘎-25治疗后，神经功能缺损有所减轻，梗死灶体积缩小，血清TNF-α、IL-1β水平降低，达到了药物干预的保护作用。蒙药民间有许多成方可以治疗缺血性脑血管疾病，但蒙医临床上最常用的只有三种：珍宝丸、扎冲十三味和黑苏噶-25，这三种药中黑苏噶-25研究的最少，可能与药物成分多，利用现代工艺难以提取有效成分，而且价格昂贵有关。参照《中国药典》2005年版，蒙药黑苏嘎-25，性味咸寒，具有解毒，愈伤，除协日乌素，清脑退翳，主治白脉病，中风，偏瘫、半身不遂脑伤，协日乌素病，眼翳白斑，骨折，创伤，颈强等功效〔8〕。本实验通过药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算表，根据人的用药剂量换算出Wistar大鼠的用药剂量。

研究表明脑缺血早期TNF-α的表达迅速增加是脑梗死形成的主要原因〔9〕，郭顺华等〔10〕用Northern印迹方法观察到在缺血后1 h缺血侧神经元即有TNF-α mRNA的表达，24 h达高峰。本实验结果提示脑缺血再灌注过程中TNF-α的水平增加；黑苏嘎-25能减少血清TNF-α的水平，对脑缺血再灌注后的损伤具有脑保护作用。IL-1β导致血栓形成，诱导小胶质细胞释放细胞因子、自由基等促进脑缺血后炎症介质的损伤作用，引起神经元损伤。IL-1β还能增加细胞间黏附分子(ICAM)-1在脑缺血中的表达水平。ICAM-1可使介导白细胞和内皮细胞的紧密黏附，阻塞微血管，降低脑血流。

本研究显示黑苏嘎-25的应用明显改善了脑缺血的神经损伤程度及减少了脑梗死灶体积，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，可能是抑制了TNF-α及IL-1β活性而产生明显的神经保护作用〔5〕，从而减轻脑缺血再灌注所造成的神经功能损伤。因以上用药剂量是根据人的用药剂量换算出Wistar大鼠的用药剂量，并以此标准确定为大鼠用药的中剂量治疗组，如果把此标准确定为低剂量治疗组，也就是说增加用药剂量，其治疗效果有待进一步研究。

综上，本研究表明黑苏嘎-25能够减少局灶性脑缺血大鼠的神经功能缺损评分及缩小局灶性脑缺血大鼠的脑梗死面积，降低局灶性脑缺血后血清TNF-α、IL-1β水平，抑制TNF-α、IL-1β的表达，可能参与了黑苏嘎-25对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑保护作用。

4参考文献

1游然，幸敏丽，沈海滔，等.缺血性脑血管疾病的发病机制及治疗药物〔J〕.医学进展，2009；33(6)：247-53.

2朱晋，仲骏.脑缺血再灌注损伤的研究进展〔J〕.国际神经病学神经外科学杂志，2008；35(1)：46-50.

3蔡世昌，白波，张秋玲.脑缺血再灌注后神经细胞再生研究进展〔J〕.解剖学研究，2012；34(1)：54-7.

4Chen B，Liao WQ，Xu N，etal.Adiponectin protects against cerebral ischemia reperfusion injury through antiinflammatory action〔J〕.Brain Res，2009；1273(4)：129-37.

5梁健芬，董少龙，窦维华，等.水蛭注射液对大鼠脑缺血再灌注后TNF-α、IL-1β和ICAM-1蛋白表达的影响[J].陕西医学杂志，2006；35(12)：1605.

6Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

7Xu Z，Xu RX，Liu BS，etal.Time window characteristics of cultured rat hippocampal rat hippocampal neurons subjected to ischemia and reperfusion〔J〕.Chin J Traumatol， 2005；8(3)：179-82.

8国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草·蒙药卷〔M〕.上海：上海科学技术出版社，2002：429.

9刘一鸥，金便芬，张林静，等.脑梗死患者血浆脂联素和肿瘤坏死因子-α与病情轻重的关系〔J〕.中国全科医学，2007；10(20)：1681.

10郭顺华，丁洁，杨霁云.中国Alport综合征临床特点与研究现状〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，1999；8(1)：71-3.

〔2014-01-15修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)