补肾健脾、扶正祛邪中药在荷瘤小鼠化疗过程中的减毒增效作用

补肾健脾、扶正祛邪中药在荷瘤小鼠化疗过程中的减毒增效作用

张江华李恩李彬

(河北医科大学中西医结合研究所，河北石家庄050017)

摘要〔〕目的通过体内实验研究扶正祛邪中药的抗肿瘤作用及对外周血细胞凋亡的影响。方法采用昆明小鼠肉瘤移植模型，随机分为5组：正常对照组，肿瘤模型组，中药治疗组，环磷酰胺治疗组，中药+环磷酰胺治疗组，观察抑瘤效应并检测肿瘤生长抑制率、平均存活期、血清乳酸脱氢酶(LDH)活性、外周血象及对荷瘤小鼠外周血细胞凋亡。结果各实验组对荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用，环磷酰胺(CTX)+中药治疗组抑瘤率达到81.4%；中药治疗或CTX+中药治疗后肿瘤生长受到抑制，与肿瘤生长抑制率一致，减轻化疗的骨髓抑制作用。结论CTX联合中药治疗具有抗癌、减轻骨髓抑制作用，拮抗CTX的毒副作用，进一步延长荷瘤小鼠的寿命的作用。

关键词〔〕中药；化疗；减毒增效

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

通讯作者：李恩(1929-)，男，教授，博士生导师，主要从事中西医结合基础和临床研究。

第一作者：张江华(1976-)，女，副教授，博士，主要从事中西医结合基础研究。

细胞凋亡是化疗后恶性肿瘤细胞死亡的主要方式之一。既往一些实体瘤和肿瘤细胞株的凋亡研究工作都证实〔1～3〕，癌细胞在化疗药物作用下都出现细胞凋亡明显增高的现象。但是化疗药物对外周血细胞凋亡情况，未引起足够的重视。中医对于恶性肿瘤治疗的研究多集中于提高机体免疫力，增强患者对放、化疗的敏感性，抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡等方面〔4，5〕。目前一致认为肿瘤病人各病期多有气血阴阳虚损之症，采用和虚则补之，扶正固本，中西医药并用，既攻又补，以达到治疗肿瘤又不损伤机体元气的目的。本文观察“补肾健脾，祛痰散结”中药的抗癌作用及对化疗毒性的拮抗作用。

1材料与方法

1.1药物补肾健脾、扶正祛邪中药由枸杞子，茯苓，人参，生薏米仁，白术，当归，清半夏，首乌等组成(水煎、过滤、浓缩按成人剂量的15倍制成含生药1.05 g/ml)，由河北医科大学附属河北省中医院中药房提供。

1.2实验细胞株肉瘤S180，由河北医科大学实验动物中心实验动物研究室提供。

1.3主要试剂、药品及仪器四甲基偶氮唑蓝(MTT)，二甲基甲酰胺均为美国Sigma公司产品；DMEM培养基(Gibco产品)；乳酸脱氢酶(LDH)检验试剂盒(南京建成生物工程研究所)；环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号0608155)。CO2培养箱、倒置显微镜(重庆光学仪器厂制造)。

1.4建立小鼠肉瘤移植模型及给药取昆明鼠18～22 g 90只(合格证书：冀医动之第036号)，SPF级，雌雄各半，随机分为5组：正常对照组，模型组，中药治疗组，环磷酰胺(CTX)治疗组，中药+环磷酰胺治疗组，每组18只。模型组和各治疗组右腋皮下接种S180细胞0.2 ml/只(细胞浓度为5×106/ml)，造成实体瘤模型。所有小鼠均从接种肿瘤细胞之日起同时给药，中药0.4 ml·kg-1·d-1灌胃，CTX腹腔注射30 mg·kg-1·d-1(剂量按体重计算相当于成人的10～15倍)，连续给药10 d，对照组给予水。

1.5肿瘤生长抑制率于末次给药后次日，每组随机处死动物8只剥离瘤称重，并观察剩余动物死亡时间，按公式计算肿瘤抑制率和存活延长率。

1.6药物对荷瘤小鼠血清乳酸脱氢酶LDH活性的影响分离血清，按LDH试剂盒说明测定血清LDH的活性。

1.7药物对荷瘤小鼠外周血白细胞的影响取外周血1 ml，分离单个核细胞，PBS洗涤，70%乙醇固定，PBS洗涤，RNA酶消化PI染色，FACS分析细胞凋亡率、S期细胞比率(SPF)及增殖指数(PI)。

1.8药物对荷瘤小鼠红细胞、血红蛋白及血清促红细胞生成素(EPO)的影响取抗凝血采用常规计数法计数红细胞;高铁氰化钾法测血红蛋白含量；胎肝细胞法测EPO活力。

1.9药物对肿瘤组织凋亡的影响取各组S180实体瘤，PBS洗涤,剪成1 mm3大小，70%乙醇固定，蛋白酶K消化，PI染色，FACS流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期。

1.10统计学方法采用SPSS17.0软件行ANOVA单因素方差分析方法，使用LSD方法进行多重比较。

2结果

2.1肿瘤生长抑制率各实验组对荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用，CTX治疗组、中药治疗组及CTX+中药治疗组对肿瘤生长的抑制率与模型组相比差异显著(P<0.01，P<0.05)。见表1。

表1　扶正祛邪复方对S180的抑瘤作用

与模型组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

2.2荷瘤动物平均存活期CTX治疗组，中药治疗组，CTX+中药治疗组动物的存活时间分别为：(12.6±2.2)d，(11.8±4.2)d，(14.2±1.3)d与模型组(8.3±0.8)d相比差异显著(P<0.01或P<0.05)。

2.3血清LDH活性测定模型组血清LDH活性为(92.35±32.14)U/ml，与正常对照组(63.74±26.53)U/ml比较差异显著(P<0.05)，中药治疗组为(81.42±18.43)U/ml，与模型组比较有所下降但无显著差异(P>0.05)。CTX治疗组为(59.37±27.66)U/ml，CTX+中药治疗组为(52.29±34.23)U/ml，与模型组差异显著(P<0.05)，表明化疗，中药治疗或CTX+中药治疗后肿瘤生长受到抑制，与肿瘤生长抑制率一致。

2.4药物对荷瘤小鼠外周血白细胞凋亡的影响荷瘤小鼠外周血白细胞的凋亡率，SPF和PI均明显高于正常对照组(P<0.01或<0.05)；CTX治疗组凋亡率进一步升高与模型组比较差异显著(P<0.05)，SPF和PI均有所降低，PI降低尤为明显(P<0.01)；中药治疗组外周血细胞凋亡率明显下降(P<0.01)，SPF和PI均有所升高但无显著意义(P>0.05)，PI值明显升高(P<0.05)。见表2。

表2　药物对S180荷瘤小鼠外周

与正常对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与模型组比较：3)P<0.01，4)P<0.05；与CTX治疗组比较：5)P<0.05

2.5药物对荷瘤小鼠红细胞，血红蛋白及血清EPO的影响①正常对照组小鼠红细胞计数为(9.3±1.0)×107个/ml；模型对照组为(9.0±0.8)×107个/ml，中药治疗组为(9.6±0.5)×107个/ml，CTX化疗组下降到(7.3±0.6)×107个/ml(与模型组比较P<0.01)，CTX+中药治疗组为(9.4±1.3)×107个/ml(与CTX治疗组比较P<0.01)。②正常对照组小鼠血红蛋白含量为(12.0±1.6)g/100 ml，模型组为(11.5±1.2)g/100 ml，中药治疗组为(11.1±0.9)g/100 ml，CTX治疗组为(8.2±0.9)g/100 ml(与模型组比较P<0.01)，CTX+中药治疗组为(12.8±2.8)g/100 ml(与CTX治疗组比较P<0.01)。③正常对照组小鼠EPO的活性为(18.1±8.0)mU/ml,模型组为(18.7±8.6)mU/ml，中药治疗组为(26.4±8.6)mU/ml，与模型组比较无显著差异(P>0.05)，CTX治疗组为(44.4±8.3)mU/ml，与模型组比较差异显著(P<0.05)，CTX+中药治疗组为(28.7±9.2)mU/ml，与CTX治疗组比较差异显著(P<0.05)。

3讨论

就环磷酰胺来讲，虽然对多种恶性淋巴瘤、白血病等有较好的疗效，但同时其毒性作用也相当严重：免疫抑制，骨髓抑制，各种血细胞减少，肝肾毒性，恶心，呕吐，脱发等〔6，7〕。本实验证实，CTX在诱导恶性肿瘤细胞凋亡的同时，也导致外周血白细胞凋亡，红细胞减少，血红蛋白降低的贫血症状。从中医角度，化疗副反应主要表现为损伤气血，脾胃失调及肝肾亏损等证候。

中医认为，癌症属中医外科的“阴毒恶论”，“石瘤”，“积聚”和“贮痰”等。不管“里寒阴毒证”。特别是中晚期患者，其病灶中所加的物质有属中医的“里寒湿证”。从临床表现来看，患者大多为痰湿蕴结，阳气不足或“阳虚寒湿”的共同病机，从损害的程度来看，大多表现为脾、肾、肺、肝、胃等的氧气亏虚。现代医学对中医药在肿瘤治疗中的作用已进行了广泛的研究，鉴于数代人的认识，综合拟定以“补肾健脾，祛痰散结”为主的治疗大法，通过温补人体阳气和甘酸寒味之品的配伍，调理脏腑，经络，气血，阴阳，又兼攻坚消积，抗肿瘤，研究扶正祛邪复方对实验肿瘤的治疗作用及减轻化疗毒副反应的作用，具有互补，达到减毒增效的目的。

本实验结果显示正常小鼠外周血细胞凋亡和增殖趋于平衡,荷瘤小鼠外周血细胞凋亡明显较正常小鼠多，细胞增殖活性变化不大，化疗后细胞凋亡进一步增多，细胞增殖活性却显著降低，合并中药治疗可防止化疗对荷瘤小鼠外周血细胞的这种作用，单纯中药又降低荷瘤小鼠外周血细胞凋亡率和提高细胞增殖活性的趋势。据现有资料分析〔8〕，恶性肿瘤患者外周血细胞凋亡增加的原因有：①外周血免疫细胞通过凋亡机制的清除，肿瘤细胞侵入外周血中，成为新的抗原，刺激机体免疫系统，使免疫细胞数量增加，功能增强，免疫系统在执行功能过程中有大量免疫细胞凋亡，没有免疫细胞凋亡，机体就不会有健全的免疫防御系统。②化疗药物作用肿瘤患者机体后，不仅诱导肿瘤细胞凋亡，同时也诱导正常体细胞和淋巴细胞凋亡。本实验结果与此一致。

本实验表明，该复方能阻止CTX对白细胞，红细胞，血红蛋白的降低作用。肾性贫血是血清EPO水平升高较少，肾衰时EPO产生不足。CTX可因骨髓抑制引起小鼠外周血红细胞及HB降低，导致血清EPO水平代偿性升高。本实验中扶正祛邪复方可改善骨髓造血抑制CTX引起的血清EPO水平代偿性升高，表明中药的整体调节作用。

该复方单独应用及与CTX联合应用治疗S180实验肿瘤小鼠表明：该复方能抑制肿瘤生长延长荷瘤小鼠寿命，与CTX联合应用时可拮抗CTX的毒副作用，进一步延长荷瘤小鼠的寿命，从不同侧面为该方药的临床应用提供了理论依据。

4参考文献

1Xu RC，Chen XY，Chen L.The initial research on hoptoad inducing human HL-60 cell apoptosis〔J〕.Chin J Chin Med，2001；26(1)：59-61.

2Rong Y，Liang FY，Chen L.The dehydromethyl organies of tiger beetle inducing the lineages of mammary cancer apoptosis and influencing the expression of bcl-2〔J〕.Cancer，2000；19(12)： 1077-81.

3Liu CX，Gao G，Sun M,etal.Study on compound-polysaccharide of fungi inducing liver cancer Bel-7402 cell apoptosis〔J〕.J Hyg Res，2001； 30(1)：40-3.

4袁宗军.中西医结合治疗恶性肿瘤探讨〔J〕.中医药研究，2002；18(3)：61.

5郁仁存.中西医结合肿瘤防治研究的进展〔J〕.中国肿瘤，1999；8(10)：461.

6谭先杰，吴呜，郎景和.妇科恶性肿瘤化疗后骨髓抑制处理中的实用问题〔J〕.实用妇产科杂志，2009；25(5):272.

7陈志伟，祝彼得，严苏纯，等.骨髓抑制性贫血小鼠模型的研究〔J〕.中国比较医学杂志，2006；16(5):260-2.

8周振英，张军妮，朱月清.香菇多糖对肿瘤患者外周血细胞凋亡的影响〔J〕.中国肿瘤生物治疗学杂志，1997；4(3)：233.

〔2013-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)