温补肾阳法对肾阳虚肺纤维化大鼠肺内CTGF表达的影响

2015-12-29 03:31赵敏,徐安莉,周艳艳
中国老年学杂志 2015年2期
关键词:肾阳虚肺纤维化

温补肾阳法对肾阳虚肺纤维化大鼠肺内CTGF表达的影响

赵敏徐安莉周艳艳陈会敏黄陈伟

(湖北中医药大学基础医学院,湖北武汉430061)

摘要〔〕目的探讨温补肾阳法治疗肾阳虚肺纤维化(PF)的作用及机制。方法60只雄性6周龄Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组和干预组,采用一次性博来霉素A5气管插管给药加腺嘌呤连续灌胃28 d复制肾阳虚PF大鼠模型。正常组大鼠气管插管给予生理盐水加等渗生理盐水灌胃作为对照,模型组大鼠造模后生理盐水灌胃14 d,干预组大鼠造模后加味参附汤灌胃14 d,每组于实验第42天处死大鼠,留24 h尿液检测17-羟皮质类固醇(17-OH-CS)含量,同时,HE和MASSON染色观察肺纤维化程度,免疫组化法和Western印迹测定大鼠肺内结缔组织生长因子(CTGF)蛋白的表达,RT-PCR检测肺组织CTGF mRNA的表达。结果与正常组比较,肾阳虚肺纤维化模型大鼠尿17-OH-CS明显下降,模型大鼠肺组织内可见肺泡结构大量破坏,大量胶原沉积,干预组大鼠肺泡结构也基本消失,可见较多的胶原沉积,病理组织学表现明显轻于模型组。与正常组比较,模型组肺组织CTGF在肺内的表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,干预组大鼠肺内CTGF的表达降低(P<0.05)。结论肾阳虚PF大鼠肾阳虚症状明显,肺内纤维化表现明显,造模成功,加味参附汤可以改善大鼠肾阳虚症状,可能通过抑制CTGF蛋白表达而缓解肺内胶原的进一步沉积减缓肺纤维化的发展。

关键词〔〕肾阳虚;肺纤维化;温补肾阳法;CTGF

中图分类号〔〕R563.9〔

基金项目:国家自然科学基金(No.81202615)

The expression of CTGF in the lungs of rats with kidney yang deficiency of pulmonary fibrosis by warming and Tonifying Kidney Yang method

ZHAO Min,XU An-Li,ZHOU Yan-Yan,etal.

Hubei University of Chinese Medicine,Basic Medical College,Wuhan 430061,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the expression of CTGF in the lungs of rats with kidney yang deficiency of pulmonary fibrosis by warming and Tonifying Kidney Yang method. Methods60 6-week-old male Wistar rats were randomly divided into normal,model and intervention groups. The rats of normal and model groups were given saline irrigation stomach,the rats of intervention group were given modified Shenfu decoction for 14 d. The content of 17-hydroxyl cortex steroids(17-OHCS) of 24 h urine was measured,lung fiber was observed by HE and MASSON staining,the expressions of CTGF protein and mRNA in lung tissue were tested by Western blot and RT-PCR.ResultsCompared with that of control group,and the content of 17-OHCS in model group was lower,decreased alveolar structures of kidney-Yang deficiency model of pulmonary fibrosis rats were destroyed,a large number of collagen was deposited;alveolar structures in intervention group were also disappeared,more collagen was deposited,but the pathological histology changes were significantly lighter than those of model group. Compared with that of control group,the expression of CTGF in pulmonary tissue of model group was increased(P<0.05),and it was lower in intervention group than that in model group(P<0.05).ConclusionsModified Shenfu decoction could improve the symptoms of kidney yang deficiency rats,and inhibit the expression of CTGF,relief further deposition of collagen in lung, slow down the development of pulmonary fibrosis.

【Key words】Kidney-yang deficiency;Lung fibrosis;Warming and Tonifying Kidney Yang method;CTGF

第一作者:赵敏(1980-),女,讲师,博士在读,主要从事五脏相关研究。

肺纤维化(PF)是多种肺系慢性疾病的共同结局,肺泡上皮细胞及内皮细胞损伤、成纤维细胞增殖、胶原过度沉积、肺泡结构遭破坏是其典型的病理学特点,研究显示结缔组织生长因子(CTGF)可以介导成纤维细胞增殖和细胞外基质(ECM)产生,在肺纤维化中起关键作用〔1,2〕。患者出现肺纤维化的临床症状往往已是肺系疾病的慢性迁延期,“络虚不荣,虚实夹杂”为慢性迁延期病机特点,中医治疗认为“大凡络虚,通补最宜”,故通补兼施,寓通于补为肺纤维化慢性迁延期总的施治原则。“肾为生气之根,肺为生气之主。”临床中医治疗特发性肺纤维化时,许多医家都考虑到了肾主纳气、辅助呼吸的作用。本实验拟采用温补肾肺、活血化痰的加味参附汤对肾阳虚肺纤维化的模型大鼠进行干预,通过CTGF在肺内的表达,确定温补肾阳在临床中药防治肺纤维化的作用效果及其可能机制。

1材料与方法

1.1动物健康Wistar大鼠60只,6周龄,体重(200±20)g,SPF级别,雌雄各半,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(鄂)2004-0007。实验大鼠自由饮水和采食,室温(25±1)℃,光照明暗各12 h,适应性喂养1 w后进行实验。

1.2药物及制备氢化可的松注射液(10 mg/2 ml),由上海现代哈森(商丘)药业有限公司生产(批号:11072512,国药准字H41021930)。腺嘌呤:(Amresco公司分装产品,北京欣经科生物技术有限公司),5 g由蒸馏水溶解为20 mg/ml的水溶液;加味参附汤:附子、人参、蛤蚧、地龙、水蛭、法半夏购于湖北省中医院,常规煎煮制成2.0 g/ml的加味参附汤,避光4℃冰箱保存,2 w内有效;博来霉素A5(15 mg/支)为天津太河制药有限公司(生产批号:060401)生产,临用前将博来霉素A5溶于蒸馏水中,并于超声波振荡15 min以保证分散均匀,稀释为5 mg/ml的混悬液,即配即用。

1.3主要试剂CTGF单克隆抗体(sc-365970),Santa Cruz公司分装,辣根酶标记羊抗鼠二抗,蛋白Marker:美国Amresco公司;免疫组化试剂盒:武汉博士德公司;RNAlater组织保护液公司,Trizol组织裂解液:美国Invitrigen公司;逆转录试剂盒:Promega公司,PCR试剂盒及荧光定量PCR试剂(SYBRGreen Premix ExTaqTM):日本TOYOBO公司;PCR引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.4方法

1.4.1动物造模参照杨礼腾等〔3〕制作肾阳虚肺纤维化大鼠模型,大鼠称重后经乙醚麻醉,气管内插管一次性注入博来霉素A5(5 mg/kg),从当天开始灌胃腺嘌呤(300 mg/kg体重)连续28 d,建立肾阳虚肺纤维化模型。

1.4.2动物分组和给药方法Wistar大鼠适应性喂养1 w,随机分为正常组、模型组、干预组,每组20只。正常组气管内插管注入生理盐水(1 ml/kg体重),2 h后,生理盐水(15 ml/kg体重)灌胃连续28 d,后生理盐水(5 mg/kg)继续灌胃1连续14 d后处死。模型组气管内插管一次性注入博来霉素A5(1 ml/kg),2 h后,每天腺嘌呤(15 ml/kg)灌胃,连续28 d,然后大鼠生理盐水(5 mg/kg体重)灌胃,每天一次,连续14 d后处死。干预组气管内插管一次性注入博来霉素A5(1 ml/kg),2 h后,每天腺嘌呤(15 ml/kg)灌胃连续28 d,然后大鼠“加味参附汤”水煎剂(5 ml/kg)灌胃,每天一次,连续14 d后处死。

1.4.3标本采集及指标检测

1.4.3.1尿17-羟皮质类固醇(17-OH-CS)的检测实验第42天,将大鼠依次置于相应标记的大鼠代谢笼内,为了增加尿量,于早8∶00到晚11∶00每间隔3 h灌胃生理盐水2 ml,共6次。收集24 h尿液,滴加防腐剂0.1 ml/10 ml防腐,-20℃保存,高岭土法进行17-羟皮质类固醇(17-OH-CS)的检测。

1.4.3.2HE染色观察大鼠肺组织病理组织结构颈动脉放血处死实验大鼠,取肺组织投入10%中性甲醛磷酸盐缓冲液固定,常规石蜡切片、HE染色观察各组实验大鼠肺组织显微镜下形态学特点,按照Szapiel等〔4〕提供的方法,对实验大鼠肺泡炎及肺纤维化程度进行半定量分析。

1.4.3.3MASSON染色观察各组大鼠肺组织纤维化程度肺组织石蜡切片进行脱蜡至水,依次自来水和蒸馏水洗,Mayer苏木素溶液染核7~9 min,充分水洗,如过染可盐酸酒精分化,用Masson 丽春红酸性复红液5~10 min,入冰醋酸水溶液中浸洗片刻,移入1%磷钼酸水溶液分化3~5 min,不经水洗,直接移入亮绿水溶液中浸染5 min,入冰醋酸水溶液中浸洗,95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。结果判断:绿色:胶原纤维;橘红色:红细胞;红色:细胞质;深蓝色:细胞核。

1.4.3.4免疫组化检测CTGF在肺内的表达肺组织石蜡切片进行脱蜡至水,经3%过氧化氢室温孵育、水洗,抗原热修复,按试剂盒说明书行常规SP水平法染色,PBS代替一抗做阴性对照。胞质、胞核出现棕黄色颗粒为阳性表现,全自动数码显微镜捕捉到图像采集窗口的免疫组化彩色图像,通过灰度直方图来调节分割范围和阈值,已分割好的图像自动计算每个阳性细胞的平均灰度值〔5〕。

1.4.3.5Western印迹检测CTGF含量肺组织加细胞裂解液经机械和超声匀浆,4℃低温,12 000 r/min离心10 min,离心半径10 cm。BCA法测总蛋白质浓度。制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶,各样品取50 μg总蛋白上样电泳,分离蛋白并转到硝酸纤维素滤膜上, 转膜完毕后,用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温摇床封闭,加入一抗4℃过夜,TBST洗膜后加入HRP标记的二抗以结合一抗,室温摇床孵育2 h,TBST洗膜,化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。使用BandScan软件分析胶片灰度值。

1.4.3.6RT-PCR检测CTGF mRNA含量用匀浆器搅匀肺组织样品,每50~100 mg组织加入1 ml Trizol,提取总RNA,按试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA,然后进行PCR扩增。引物序列如下:CTGF上游引物:5′-CCAATGACAATACCTTCTGC-3′,下游引物:5′-GAAAGCTAAACTTGACAGG-3′,产物长度148 bp;β-actin上游引物:5′-GTATGACTCTACCCACGGCCAAG-3′,下游引物:5′-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′,产物长度101 bp。反应完成后,软件将自动进行数据分析,调整基线,计算Threshold cycle(Ct值)。采用2-△△CT法〔6〕分析基因的相对表达量。

1.5统计学处理应用SPSS19.0统计学分析软件进行t检验及方差分析。

2结果

2.1实验大鼠一般情况正常组大鼠一般状态好取食活跃、体重增加、皮毛光滑、口唇红润;第28天模型组和干预组大鼠取食排便活动均减少、出现毛发无光泽、竖毛、精神萎靡、反应迟钝、体温下降、倦缩拱背、口唇苍白、尾巴湿冷、大便稀软;第42天模型组大鼠出现毛发脱落,嗜睡、体重进一步下降,而干预组大鼠活动较42 d略有恢复,取食较活跃、体重稍有增加。

2.2各组大鼠肺组织病理学变化对照组:大鼠肺组织结构清晰,气管及支气管黏膜上皮细胞排列尚规整,杯状细胞增生,肺内各级小支气管、细支气管及其伴行的管壁及周围有少许中性粒细胞及淋巴细胞浸润,血管腔充血。肺泡间隔基本正常,肺泡上皮细胞结构完整,间质可见少量红细胞浸润,MASSON染色在肺间质内可见少量条索状胶原纤维。模型组:大鼠肺组织结构破坏明显,气管及支气管黏膜上皮细胞排列紊乱,杯状细胞大量增生,肺内各级小支气管、细支气管及其伴行的管壁及周围可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,肺泡间隔明显增宽,几乎未见正常肺泡结构,肺泡明显萎缩塌陷,MASSON染色可见大量宽带状及片状胶原纤维,呈弥漫性肺纤维化改变。干预组:大鼠肺组织结构明显破坏,气管及支气管黏膜上皮细胞增生明显,肺内各级小支气管、细支气管及其伴行的管壁及周围可见较多中性粒细胞及淋巴细胞浸润,肺泡间隔稍增宽,部分肺泡腔消失,为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据,MASSON染色可见部分肺间质为胶原纤维所填充。见图1,图2。

模型组在造模期间因气管插管引起强烈刺激而死亡两只,在后期因衰竭而死亡两只,故最后为16只,干预组在造模期间因气管插管引起强烈刺激而死亡两只,故最后为18只,与模型组进行比较,干预组实验大鼠肺泡炎程度和肺纤维化程度较轻(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠肺泡炎与肺纤维化程度的形态学观察 ± s)

与正常组比较:1)P<0.05;与模型组比较:2)P<0.05;下表同

图1 大鼠肺组织病理组织学检查(HE,×40)

图2 各组大鼠肺组织MASSON染色(×100)

2.3实验大鼠尿17-OH-CS含量与对照组〔(13.604±2.521)mmol/L〕比较,模型组〔(5.324±2.412)mmol/L〕和干预组〔(11.927±0.848)mmol/L〕大鼠的尿17-OH-CS含量较正常组降低(P<0.05),与模型组相比较,干预组大鼠尿17-OHCS含量明显升高(P<0.05)。

2.4实验大鼠免疫组化检测CTGF在肺内的表达检测结果与正常组比较,模型组大鼠平均灰度值显著升高(P<0.05),干预组大鼠平均灰度值显著升高(P<0.05);与模型组比较,干预组大鼠平均灰度值显著降低(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠肺组织CTGF阳性细胞、CTGF蛋白的

2.5实验大鼠Western印迹检测肺内CTGF蛋白表达检测结果正常组CTGF蛋白的灰度值最小,条带最细,模型组CTGF蛋白灰度值最大,条带最粗。与正常组比较,模型组大鼠平均灰度值显著升高(P<0.05),干预组大鼠平均灰度值显著升高(P<0.05);与模型组比较,干预组大鼠平均灰度值显著降低(P<0.05),见表2。

2.6实验大鼠肺内CTGF mRNA含量检测结果与正常组比较,模型组和干预组大鼠肺内CTGF mRNA表达明显增高(P<0.05),与模型组比较,干预组中CTGF mRNA表达强度明显降低(P<0.05),见表2。

3讨论

中医经典文献中没有和肺纤维化相同的病名,学者们认为肺纤维化属于中医学“肺痿”范畴〔7〕,发病多与体质虚弱、饮食、劳倦、内伤等因素有关,又复感外邪,导致肺气先伤,故有呼吸急促、气短之状;肾为肺之子,主纳气,为气之根,肺病虚损,久则母病及子,造成肾气虚弱,不能纳气归元,导致气浮于上,故发为喘促,动则尤甚。气管灌注博来霉素是西医研究肺纤维化的经典模型,为了符合中医辨证论治的特点,并结合临床常用的证型,我们选择了肾阳虚肺纤维化模型。

研究表明,在正常肺组织中,细胞外基质(ECM)是一种高度动态的基质,它的合成与降解受到精确地调节,许多细胞因子及通路参与了肺内基质合成和降解的过程,不过在慢性肺损伤过程中,ECM的合成远远超过其降解,结果就是逐步形成铁丝网格纤维隔膜,以及胶原蛋白之间的化学交联,最终形成肺纤维化。Pan等〔2〕观察到在肺纤维化患者肺组织中可见CTGF表达在增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞和活化的成纤维细胞这两种细胞中,而且患者CTGF蛋白和mRNA表达明显上调,提示肺纤维化的组织细胞可以通过产生CTGF,直接刺激纤维生成,导致肺组织内ECM增生,肺泡结果破坏,肺实质细胞被瘢痕组织取代,最终造成肺纤维化。CTGF可作为抗纤维化治疗很有吸引力的靶基因,生理条件下表达水平很低,其作用范围也主要局限于结缔组织,CTGF具有较强的丝裂原活性,能刺激成纤维细胞的活化、增殖,能促进多种ECM成分如蛋白多糖、糖蛋白胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ以及纤维连接蛋白、层黏蛋白的产生;抑制ECM的降解,能够介导成纤维细胞的黏附,促进成纤维细胞向纤维连接蛋白黏附的作用〔8〕。CTGF高表达可以使血管平滑肌细胞的生长率、迁移率显著增加,还可以促进胚胎发育、损伤修复及移植,促进新生血管的生成等。刘涛等〔9〕研究发现苦参碱及地塞米松可能是通过抑制TGF-β1和CTGF的表达来减少Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的生成,从而减缓肺纤维化的形成。刘朝阳等〔10〕研究发现CTGF单链抗体可明显减轻纤维化程度,有可能成为治疗肺纤维化一种新的药物。以上研究表明CTGF蛋白通过促进ECM的生成而加速肺纤维化的发生和发展。

《类证治裁·肺痈肺萎叶》指出:“肺萎伤在无形之气,气伤则调其元。”肺纤维化的干预上应以扶正固本为主,以益气补肺益肾为法,佐以活瘀。基于前期研究显示〔11〕该肾阳虚肺纤维化模型是成功的,加味参附汤可以明显抑制肺内细胞的凋亡,因此本次实验在成功复制肾阳虚肺纤维化模型后,以益气温阳的参附汤为主方,进行加减组成由附子、人参、蛤蚧、地龙、水蛭、法半夏组成的“加味参附汤”对实验大鼠进行干预,发现加味参附汤干预的实验大鼠肺内CTGF表达明显低于模型组,因此我们推测加味参附汤除了抑制肺内细胞的凋亡,其抑制肺泡上皮细胞和活化的成纤维细胞中CTGF的表达、改善肺内胶原的沉积,也可能是该方减缓肺纤维化发生的又一机制,这为温补肾阳法的临床应用提供了一定的实验依据。

4参考文献

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9刘涛,谢敏,王浩凌,等.苦参碱、γ干扰素对大鼠肺纤维化干预作用〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版),2008;28(5):592-6.

10刘朝阳,王西华.结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度及羟脯氨酸含量的影响〔J〕.东南大学学报,2010;29(2):135-8.

11赵敏,周艳艳.加味参附汤对肾阳虚肺纤维化大鼠凋亡相关因子caspase-3和Bcl-2表达的影响〔J〕.新中医,2014;46(1);178-80.

〔2013-06-15修回〕

(编辑李相军)

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