荧光分析法研究水杨酸磺胺类似物与牛血清白蛋白的作用机制

廖乙媚，陈 虹，秦 箐，，莫建赧，刘布鸣，蒙法艳，周朝霞，林翠梧

（1.广西医科大学药学院，广西南宁530021；2.广西大学化学化工学院，广西南宁530004；3.广西壮族自治区中医药研究院，广西南宁530022；4.广西中药质量标准重点实验室，广西南宁530022；5.广西卫生职业技术学院，广西南宁530023）

板蓝根来源于草大青、植物马蓝、菘蓝的干燥根，是中国常用的中药材。可用于预防感冒、咽喉疼痛等，研究表明板蓝根还具有抗病毒、抗菌、增强免疫功能的作用。在我们前期的研究工作中发现，板蓝根与免疫抑制剂联用能延长心脏移植手术小鼠的生存时间［1－2］。从板蓝根中提取分离出的水杨酸可广泛用于治疗病毒性和细菌性感染。水杨酸磺胺类似物4－（2－乙酰氧基苯甲酰）氨基磺胺间甲氧嘧啶（类似物Ⅰ）、4－（2－羟基苯甲酰）氨基磺胺间甲氧嘧啶（类似物Ⅱ）、4－（2－羟基苯甲酰）氨基磺胺二甲嘧啶（类似物Ⅲ）、4－（2－乙酰氧基苯甲酰）氨基磺胺二甲嘧啶（类似物Ⅳ）是以水杨酸和磺胺为原料合成的新化合物，结构见图1。

图1 水杨酸磺胺类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的分子结构Fig.1 Molecular structures of analogue of salicylic acid－sulfonamidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ

血清白蛋白（SA）在哺乳动物体内起着重要的贮存和运输作用［3］，可与许多内源性或外源性化合物结合。从不同角度研究其与药物的相互作用，对阐明药物的运输与代谢过程及了解蛋白质的结构与功能起着重要作用［4］。作者以牛血清白蛋白（BSA）与系列水杨酸磺胺类似物为研究对象，建立水杨酸磺胺类似物－BSA 的作用体系，采用分子荧光分析法和同步荧光猝灭法研究水杨酸磺胺类似物－BSA 作用体系的结合常数、结合位点及相应的热力学常数等，以阐明水杨酸磺胺系列类似物在体内的运输和代谢过程，为进一步的生物学研究提供重要的实验依据。

1 实验

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白（BSA，98%），合肥博美Sigma分装；水杨酸磺胺类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，本实验室合成；二甲基亚砜，BR，广东光华化学厂有限公司。

牛血清白蛋白用蒸馏水配制成1×10－4mol·L－1储备液，置于4 ℃冰箱中保存。Tris－HCl缓冲溶液（pH＝7.4，离子浓度0.1mol·L－1）。水杨酸磺胺类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ取适量分别溶于5mL 二甲基亚砜，分别用Tris－HCl缓冲溶液稀释成1×10－4mol·L－1的标准溶液。

RF－5301PC型荧光分光光度计，日本岛津；FE20型精密pH 计、PB602－N 型电子天平，梅特勒－托利多仪器上海有限公司；AG245型电子分析天平，瑞士梅特勒公司；DF－101S型集热式恒温加热器，郑州长城科工贸有限公司；移液枪，上海科华系统有限公司。

1.2 方法

分别准确吸取一定体积的水杨酸磺胺类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液于对应的10 mL 比色管中，加入1mL的BSA 储备液，用Tris－HCl缓冲溶液稀释到10mL。分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃恒温水浴下，设置激发波长λex＝295nm，激发和发射狭缝宽度均为3 nm，扫描速度为快速，灵敏度位高，在发射波长λem＝300nm 时测定发射光谱。设定发射和激发波长差为Δλ＝15nm 和Δλ＝60nm，分别扫描系列类似物－BSA体系在25 ℃时的同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 类似物－BSA作用体系的荧光猝灭光谱

BSA 由于其自身的色氨酸残基和酪氨酸残基而产生内源荧光。在实验设定条件下，固定BSA 的量，逐渐增加类似物的量，测定系列类似物－BSA 作用体系发生结合反应后的荧光强度，结果如图2所示。

图2 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系的荧光猝灭光谱Fig.2 Fluorescence quenching spectra of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由图2 可知，系列类似物－BSA 作用体系在345 nm 左右有最强峰，且随着类似物浓度的增加，BSA 的内源荧光产生有规律的猝灭，说明系列类似物均能与BSA 产生相互作用，导致荧光猝灭反应的发生。

2.2 荧光猝灭机理的确定

荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭［5］，动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，其作用过程遵循Stern－Volmer方程［6］：

式中：F0和F分别为加入类似物前后BSA 的荧光强度；Kq为双分子猝灭速率常数；KSV为猝灭常数；τ0为BSA 的平均寿命，10－8s［7］；［Q］为类似物分子浓度。

根据方程（1）可作Stern－Volmer曲线（图3）及计算相关参数，结果见表1。

图3 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系在35 ℃时的荧光猝灭常数曲线Fig.3 Stern－Volmer curves of fluorescence quenching constants of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at 35 ℃

表1 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系在35 ℃时的Stern－Volmer猝灭常数Tab.1 Stern－Volmer quenching constants of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at 35 ℃

由表1可知，系列类似物－BSA 作用体系的双分子猝灭速率常数Kq均大于2.0×1010L·mol－1·s－1，动态猝灭中各种猝灭剂和生物分子的最大分散碰撞猝灭速率常数为2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，由此可判定类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 相互作用体系的猝灭机理为静态猝灭，故可以忽略在研究的浓度范围内类似物－BSA 产生的动态碰撞。

2.3 结合常数、结合位点数的计算

根据文献［9］，对于静态猝灭，荧光猝灭强度与药物浓度之间的关系可根据校正过的Stern－Volmer方程表示：

式中：Kb为结合常数；n为结合位点数。

根据双对数回归曲线方程（2）可求出Kb值、n值及相应的R2值，结果见表2。

表2 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系在不同温度下的结合常数和结合位点Tab.2 Binding constants and binding sites of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system at different temperatures

由表2可知，系列类似物与BSA 均存在一定的结合作用，且结合位点约为1，即类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与BSA 相互作用形成1∶1的复合物。

2.4 结合模式的确定

小分子化合物与生物大分子之间的结合力包括氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力，结合作用模式主要由热力学参数焓变（ΔH）和熵变（ΔS）反映。从热力学角度看，ΔH＞0 和ΔS＞0 主要为疏水作用力，ΔH＜0和ΔS＜0反映范德华力或氢键的形成，而ΔH≈0和ΔS＞0 表明静电相互作用［10－11］。热力学参数ΔH、ΔS及自由能变ΔG可根据式（3）、（4）计算［12］：

式中：K为相应温度下的结合常数；R 为气体常数。计算得到类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 作用体系的热力学参数见表3。

表3 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系的热力学参数Tab.3 Thermodynamic parameters of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由表3可知，ΔG均为负值，可知系列类似物与BSA 的结合反应均为自发过程。类似物Ⅳ－BSA 结合反应的ΔH、ΔS均为负值，表明类似物Ⅳ－BSA 结合作用力主要为氢键和范德华力，而类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA结合反应的ΔH、ΔS均为正值，表明疏水作用力是类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA 结合反应的主要作用力。

2.5 同步荧光光谱

同步荧光光谱反映了不同发色团的性质，当发射和激发波长差设定为Δλ＝60nm 时，同步荧光光谱反映色氨酸残基（Trp residues）的特征信息；当Δλ＝15 nm 时，则反映酪氨酸残基（Tyr residues）的特征信息［13－14］。系列类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA 相互作用在25 ℃时的同步荧光光谱见图4。

图4 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系的同步荧光光谱Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

由图4可知，随着类似物的加入，同步荧光强度急剧下降，且均没有发生蓝移或者红移，表明系列类似物对BSA 色氨酸残基及酪氨酸残基微环境几乎没有影响。

类似物－BSA 结合反应过程中发生了能量的转换，即有部分能量转换为非辐射能（荧光猝灭），能量转换的多少反映药物与蛋白结合作用的强弱，能量转换越大表明结合作用越强，结合反应生成的复合物就越稳定。在同步荧光检测中，能量转换效率（荧光猝灭效率）可用方程（5）计算［15］：

式中：F0和F为BSA 溶液的荧光强度和逐步加入类似物时的同步荧光强度。以RSFQ对类似物浓度［Q］作图（图5），可看出类似物Ⅲ在△λ＝15nm 和△λ＝60nm 时的荧光能量转换率都非常低，表明类似物Ⅲ与BSA 的酪氨酸残基及色氨酸残基的结合作用不强，可以判断类似物Ⅲ可能存在着与BSA 上其它残基的结合位点。同时还可以看出类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ在△λ＝15nm 时的能量转移比在△λ＝60nm 时的能量转移低，可判断类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ更易于与BSA 分子的的色氨酸残基结合。4种药物与BSA 在酪氨酸残基和色氨酸残基两个结合位点结合作用强弱顺序为：Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ。

图5 类似物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）－BSA作用体系的同步荧光猝灭率Fig.5 Ratios of synchronous fluorescence quenching of analogue（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）－BSA system

3 结论

在pH＝7.4、离子浓度为0.1 mol·L－1的条件下，对以水杨酸和磺胺为原料合成的4个新化合物水杨酸磺胺类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行光谱分析，研究其与BSA 的相互作用。4个新化合物对BSA 的荧光猝灭机理均为静态猝灭，结合位点数约为1，形成1∶1的复合物。类似物Ⅳ与BSA 结合反应的作用力主要为氢键和范德华力，而疏水作用力是类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ－BSA结合反应的主要作用力。通过热力学常数计算，可知系列类似物与BSA 的结合反应是自发过程。同步荧光光谱显示，系列类似物对BSA 色氨酸残基及酪氨酸残基微环境几乎没有影响。通过对同步荧光猝灭的能量转换效率计算，可以判断类似物Ⅲ可能存在着与BSA 上其它残基的结合位点，同时类似物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ更易于与BSA 分子的色氨酸残基结合。

（致谢：本研究受到广西大型仪器协作公用网、广西中医药研究院广西中药质量标准研究重点实验室资助。）

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