富镉水稻秸秆纤维素酶解效率的研究

杨 双，张长波，王景安，刘仲齐

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.农业部环境保护科研监测所，天津300191）

镉（Cd）是生物毒性很强的重金属元素［1］，是植物生长和发育的非必需元素，过量会抑制植物的生长［2］。由于含镉工业污水的排放和含镉化肥、农药的长期使用，大量的镉进入农田生态系统，造成农田土壤镉含量严重超标。水稻是我国的主要农作物，全国约有60%的人口以大米为主食。与其它重金属元素相比，镉的活性较强，容易被水稻吸收和富集，可以在不影响水稻正常生长的情况下积累较高含量的镉，因此水稻镉污染具有很强的隐蔽性和危险性［3］。据不完全统计，我国受镉污染的农田面积已超过20万hm2，每年生产镉含量超标的农产品达14.6亿kg［4］，严重危害了广大人民群众的身体健康。

木质纤维素是可再生且来源广泛的可利用资源。但是木质纤维素中的纤维素不仅由木质素和半纤维素包裹着，而且纤维素分子中存在大量的氢键及结晶区、非结晶区共存的复杂形态结构，具有不熔化和在大多数溶剂中不溶解的特点［5］。木质纤维素经预处理后能打破由木质素和半纤维素构成的网状包埋结构，使纤维素与木质素、半纤维素等分离，同时纤维素内部氢键打开，成为无定形的纤维素，降低纤维素的结晶度，提高基质的孔隙度，最终提高纤维素的酶解效率、原料利用率和总得糖率［6－8］。

作者在此以不同镉含量的T 优705水稻秸秆（以下简称稻秆）为原料，采用10%NaOH 和过氧乙酸（PAA）预处理稻秆，比较不同预处理前后稻秆中镉含量的变化及其对纤维素酶解效率的影响，利用其中重金属的有意作用，合理地、最大限度地利用这些资源，为富镉稻秆的综合利用提供参考。

1 实验

1.1 稻秆的预处理

在镉污染程度不同的盆栽试验中，收集籼稻品种T 优705的秸秆，自然风干后用万能粉碎机粉碎，过60目筛，保存备用。

参照文献［9－11］，分别采用10%NaOH 和PAA 对木质纤维素进行化学预处理。

1）10%NaOH 预处理：称取粉碎稻秆10g，按料液比1∶3（g∶mL，下同）加入到10%NaOH 溶液中，在90 ℃水浴锅中保温1.5h，用水冲洗预处理后的稻秆，直至pH 值为中性，去除多余水分，重复3次，将所得稻秆残渣烘干、称量后，保存备用。

2）PAA 预处理：取稻秆，按料液比1∶1 加入15%PAA，在75 ℃水浴锅中保温3h，用水冲洗至pH值为中性，去除多余水分，重复3次，将所得稻秆残渣烘干、称量后，保存备用。

3）10%NaOH ＋PAA 复合预处理：取经10%NaOH 预处理后的稻秆残渣按上述方法进行PAA 预处理，保存备用。

1.2 镉含量的测定

参照文献［12］，分别称取稻秆和稻秆残渣0.25g于聚四氟乙烯消煮管中，加入7mL 70%硝酸泡6h后，在ED54型长管消解仪中110 ℃消煮2.5h，每隔30 min振荡一次，然后加入1mL 30%过氧化氢，继续保持110 ℃消煮1.5h，最后在180 ℃的条件下赶酸，直至所剩液体为0.5 mL 左右，定容至25 mL，过滤，用AAS ZEEnit 700型原子吸收光谱仪测定镉含量，重复3次。

1.3 酶解

在300mL锥形瓶中加入0.5g预处理前后的不同镉含量稻秆，按料液比1∶100加入pH 值为4.8的醋酸－醋酸钠缓冲溶液作为酶解体系，加入酶浓度为350U 的纤维素酶（北京鼎国公司，酶活为10 000U·g－1）1mL，在150r·min－1、50℃的条件下进行酶解。前12h每隔2h取样测定葡萄糖浓度，12h后每隔12h取样测定葡萄糖浓度，重复3 次，以无镉稻秆作为对照。

1.4 酶解产物的衍生化和GC－MS测定

纤维素酶解产生的葡萄糖没有足够的挥发性，需将其转化为挥发性衍生物才能进行GC－MS测定。本实验采用常用的硅烷化作为衍生化手段［13］，参照文献［14－15］对酶解产物进行衍生化，利用衍生化试剂N，O－双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）与经10%NaOH＋PAA 复合预处理后的稻秆酶解产物葡萄糖发生三甲基硅烷化衍生反应，获得具有良好挥发性和稳定性的衍生产物硅醚或硅酯，并用N，N－二甲基甲酰胺（DMF）作为溶剂，实现反应后衍生产物与样品残余物的两相分离，最后进行GC－MS测定。

具体过程：取50μL酶解液于衍生化试管中，真空干燥挥干溶剂后加入衍生化试剂BSTFA 和DMF 各50μL，在75 ℃的条件下进行衍生化反应，30min后，加入900μL 丙酮，并在旋涡振荡器上充分混匀，过0.22μm 的有机相滤膜后用气质联用仪（美国Agilent公司）进行GC－MS测定。

1.5 葡萄糖产量的测定

用气质联用仪进行分析测定。通过MSD 化学工作站数据处理系统，检索NIST08谱图库，将测得的谱图与标准谱图和标准样品谱图进行对照、复合，再结合有关文献进行人工谱图解析。按下式计算葡萄糖产量：

式中：GY为葡萄糖产量，g·kg－1；GC为1kg底物酶解得到的葡萄糖浓度，g·L－1；V为反应体系总体积，L；M为稻秆总质量，kg；0.9为葡萄糖的水化因子［16］。

2 结果与讨论

2.1 预处理方法对稻秆纤维素中镉含量的影响（表1）

表 1 预处理方法对稻秆纤维素中镉含量的影响／（mg·kg－1）Tab.1 Influence of pretreatment methods on cadmium content of rice straw cellulose／（mg·kg－1）

由表1 可知：（1）2 种不同镉含量的稻秆经10%NaOH 预处理后，镉含量没有明显变化，说明碱对镉的去除没有影响；（2）PAA 预处理后，2种稻秆的镉含量均降低了80%以上，说明PAA 可以去除稻秆中的镉；（3）单位质量的稻秆经过PAA 预处理后镉的流失率高达88%，经过10%NaOH＋PAA 复合预处理后镉的流失率高达99%，说明半纤维素和木质素中的镉含量至少为11%。这是因为，NaOH 有较强的脱木质素和降低结晶度的作用［6］，它和PAA 复合预处理稻秆后，稻秆中的半纤维素和木质素被全部去除［17］，同时部分纤维素也随之流失。

2.2 复合预处理对稻秆纤维素酶解效率的影响

2.2.1 复合预处理后的稻秆酶解产物衍生化后的GC－MS分析（图1）

单糖经三甲基硅烷化试剂衍生化后，产物葡萄糖分子每个羟基上的氢原子均被一个三甲基硅烷基团取代，使葡萄糖分子的极性降低［18］。由图1 可以看到，每个化合物的离子中，都含有m／z73 这个碎片离子，即三甲基硅烷正离子碎片，丰度较大，说明该化合物是三甲基硅烷化衍生产物，符合测定的结果［19］。在质谱图中产生的主要离子碎片还有：m／z204、m／z191、m／z147，其中m／z204为基峰。基峰的产生是由于葡萄糖衍生化产物的分子结构不稳定，其C1－C2键、C5－C6键断裂后，生成m／z408的离子碎片，剩余的中间四碳不稳定导致C3－C4键继续断裂，生成了稳定的m／z204离子碎片［18］，表明测得的物质即为目标产物。

由于葡萄糖分子存在α和β2 种不同构型，所以其三甲基硅烷衍生物在色谱图中同时出现2个峰［15］。在色谱条件下，目标产物在8.411 min的出峰面积很稳定（图2），与标准样品中的葡萄糖浓度呈极显著线性相关。根据未知样品的读数值和标准曲线进行比较，就能准确测定未知样品中的葡萄糖浓度。

图1 酶解产物衍生化后的GC－MS图谱Fig.1 GC－MS Spectrum of enzymatic hydrolysis sample after derivatization

图2 酶解产物衍生化后的总离子流图谱Fig.2 Total ion current chromatogram of enzymatic hydrolysis sample after derivatization

2.2.2 复合预处理对不同镉含量稻秆酶解效率的影响（图3）

由图3可看出：（1）未处理稻秆的酶解效率均很低，其中无镉稻秆随酶解时间的延长，葡萄糖浓度略有升高，从3.4g·L－1升高到3.8g·L－1；含镉稻秆的葡萄糖浓度均比无镉稻秆的葡萄糖浓度低，且随着酶解时间的延长没有明显的变化，镉含量为2mg·kg－1的稻秆葡萄糖浓度保持在3.34g·L－1，镉含量为8 mg·kg－1的稻秆葡萄糖浓度保持在3.32g·L－1。（2）不同镉含量稻秆经过10%NaOH＋PAA 复合预处理后，葡萄糖浓度均呈指数显著升高，24h后，葡萄糖浓度升幅趋缓，说明酸碱复合预处理破坏了稻秆木质纤维素的结构，碱可以润胀纤维素，酸可以溶解半纤维素、氧化木质素，都不同程度地使木质素氧化，减弱了它们之间结合的作用力，增大了纤维素酶和纤维素的作用面积［7］。（3）不同镉含量稻秆经复合预处理后酶解所得葡萄糖浓度差异显著，镉含量越高酶解效率越高，酶解72h后，无镉稻秆的葡萄糖浓度为8.28g·L－1，富镉稻秆的葡萄糖浓度为10.55g·L－1，较无镉稻秆的葡萄糖浓度高出27.4%。

图3 复合预处理对不同镉含量稻秆酶解效率的影响Fig.3 Influence of compound pretreatment on enzymatic hydrolysis efficiency of rice straw with different contents of cadmium

上述结果表明，复合预处理后，镉的存在提高了稻秆中纤维素的酶解效率，且在一定范围内，镉含量越高，纤维素的酶解效率越高。这是因为，植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶质组成［20］，细胞壁含有丰富的亲镉物质，还含有与镉关联的阳离子交换位点［21］，所以细胞壁中含有大量的镉。细胞初生细胞壁中纤维素等形成的网架结构存在许多大小不一的网孔，在较小的网孔处，带正电的镉离子被带负电的亲镉物质所吸附［22］。镉离子被纤维素的网状结构所吸收、固定。当对稻秆进行预处理后，纤维素成分中的镉连同部分亲镉物质一起被洗掉，但是原来的空隙仍然保留，结果使纤维素的比表面积增大，从而增大了纤维素与酶的接触面积，最终提高了纤维素的酶解效率。

2.3 复合预处理对稻秆葡萄糖产量的影响（图4）

由图4可看出：（1）稻秆直接酶解时，含镉稻秆的葡萄糖产量显著低于无镉稻秆；但富镉和低镉稻秆的葡萄糖产量无显著差异，无镉稻秆的葡萄糖产量为351.82g·kg－1，镉含量为2mg·kg－1的稻秆葡萄糖产量比无镉稻秆低12.3%，镉含量为8 mg·kg－1的稻秆葡萄糖产量比无镉稻秆低14.2%。（2）不同镉含量稻秆经复合预处理后再酶解时，残渣的葡萄糖产量与镉含量成正比，镉含量越高，葡萄糖产量越高，无镉稻秆葡萄糖产量为760.23g·kg－1，低镉稻秆葡萄糖产量比无镉稻秆高17.4%，富镉稻秆葡萄糖产量比无镉稻秆高27.4%。

图4 复合预处理对稻秆葡萄糖产量的影响Fig.4 Influence of compound pretreatment on yield of glucose

2.4 复合预处理前后稻秆的扫描电镜照片分析（图5）

图5 复合预处理前（a）后（b）稻秆的扫描电镜照片Fig.5 SEM Images of rice straw before（a）and after（b）compound pretreatment

由图5可看出：未经预处理的稻秆的木质纤维素结构紧密有序，表面粗糙呈块状（图5a）；经复合预处理的稻秆的晶状结构遭到破坏，表面呈条状，变得松散、光滑、柔软（图5b），稻秆的比表面积增大、孔隙度增加，易于酶解［23］。这也是预处理后水稻样品具有高葡萄糖产量的主要原因。

3 结论

采用不同的预处理方法分别对不同镉含量的稻秆进行预处理。结果表明：（1）酸可以去除稻秆中大量的镉，而碱对稻秆残渣中镉含量没有显著影响。（2）稻秆中的镉含量对稻秆纤维素的酶解效率有显著影响。镉含量越高，预处理后的酶解效率越高。未经预处理的富镉稻秆，其纤维素酶解效率低于无镉稻秆。（3）10%NaOH＋PAA 复合预处理使稻秆纤维的表面结构变得疏松，极大地提高了稻秆纤维素的酶解效率，复合预处理可使稻秆纤维素的葡萄糖产量提高1～3倍。

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