色串孢属真菌Torulasp.YMF1.03791的化学成分研究

（云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室，云南昆明650091）

色串孢属真菌属于半知菌纲、丛梗孢目（Moniliales）、暗梗孢科（Dematiaceae）、色串孢属（Torula）［1］。有关此属真菌的次生代谢产物研究主要是真菌Torulaherbarum。Kadkol等［1－2］从该真菌中分离到萘醌类化合物dehydroherbarin和herbarin，具有弱的抗细菌和真菌活性及抗阿米巴活性。Narasimhachari等［3］从该真菌中分离到化合物o－methylherbarin。耿婉丽［4］从海参共附生真菌T.herbarum中分离鉴定了15 个化合物，其中萘醌类化合物10 个、环二肽1 个、多羟基甾醇4 个，并对这些化合物进行了体外细胞毒活性实验，发现此类化合物对骨肉瘤细胞MG－63、肺癌细胞A549、结肠癌细胞Lovo均有一定的抑制活性。为此，作者对该属真菌Torulasp.YMF1.03791进行化学成分研究，并对其进行抗肿瘤、抑菌、杀线虫活性测定。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

柱层析凝胶Sephadex LH－20，Pharmacia；柱层析硅胶（200～300目）、硅胶G 板，青岛海洋化工厂。

所用有机溶剂均为重蒸工业纯试剂。

Bruker DRX－500 型超导核磁共振仪；Finnigan LCQ－Advantage型质谱仪。

1.2 菌株与培养基

菌株Torulasp.YMF1.03791，保存于云南省生物资源保护与利用重点实验室菌种库。

马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，pH 值自然。

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1 000mL，pH 值自然。

1.3 Torulasp.YMF1.03791次生代谢产物的分离

1.3.1 菌株的扩大发酵培养

首先挑取菌块（1cm×1cm）于PDA 培养基上活化，在28℃恒温条件下培养10d；再挑取菌块（1cm×1cm，3块·瓶－1）于装有100mL PDB培养基的三角瓶（250 mL）中活化（28 ℃、180r·min－1摇床培养）10d；然后按5%的接种量接种于装有250mL PDB培养基的三角瓶（500mL）中，共10L，于28 ℃、180r·min－1摇床培养20d。

1.3.2 菌株代谢产物的分离

将上述培养物过滤，分开菌丝体和发酵液。发酵液减压浓缩至1L 左右，将浓缩液用乙酸乙酯萃取3次，浓缩合并后得到粗提物0.86g。粗提物过甲醇凝胶，得到7个粗组分（A1～A7）。组分A4（108mg）过甲醇凝胶，得到3 个组分（A4－1～A4－3）。A4－2（47 mg）用等量硅胶拌样，自然风干后过正相柱，石油醚装柱，用石油醚－丙酮（20∶1）洗脱，得到化合物Ⅰ（6 mg）。

将菌丝体用甲醇浸泡，浸泡液减压浓缩后得到2.05g粗提物。粗提物过甲醇凝胶，得到5个粗组分（B1～B5）。组分B4（247mg）过甲醇凝胶，得到3个组分（B4－1～B4－3）。B4－2（77mg）用等量硅胶拌样，自然风干后过正相柱，石油醚装柱，用石油醚－乙酸乙酯（40∶1）洗脱，得到3个组分（B4－2－1～B4－2－3）。B4－2－3（42mg）用等量硅胶拌样，自然风干后过正相柱，石油醚装柱，用石油醚－乙酸乙酯（60∶1）洗脱，得到化合物Ⅱ（5mg）。

1.4 结构鉴定

分别对化合物Ⅰ、Ⅱ进行质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱分析，以确定其结构。

1.5 活性测定

1）抗肿瘤活性：选择人肺癌细胞A549、宫颈癌细胞SK－OA－3作为供试肿瘤细胞，测定化合物Ⅰ和Ⅱ的抗肿瘤活性。每个化合物选择30μg·mL－1、10μg·mL－1、3μg·mL－1、1μg·mL－1、0.3μg·mL－1、0.1 μg·mL－1等6个浓度梯度。

2）抑菌活性：将化合物Ⅰ和Ⅱ用甲醇溶解，加到滤纸片（直径0.6cm）上，使每个滤纸片上化合物含量分别为200μg、400μg、800μg。病原细菌培养24h，病原真菌培养1～4d，测量抑菌圈大小。

3）杀线虫活性：体外测定杀线虫活性。

2 结果与讨论

2.1 化合物结构鉴定

化合物Ⅰ：淡红色固体。ESI－MS：287［M ＋1］＋。1HNMR（500 MHz，CDCl3），δ：1.99（3H，s），3.93（3H，s，MeO），3.94（3H，s，MeO），5.11（2H，s），5.84（1H，m，H－4），6.70（1H，d，J＝2.4 Hz，H－8），7.22（1H，d，J＝2.4 Hz，H－6）；13CNMR（500 MHz，CDCl3），δ：20.1（q），55.9（MeO），56.5（MeO），63.4（t），93.8（d），103.6（d），104.3（d），114.6（q），124.9（q），135.4（q），135.6（q），161.6（q），163.2（q），164.1（q），180.9（q），182.23（q）。与文献值［1］相比较，确定化合物Ⅰ为dehydroherbarin（图1）。

化合物Ⅱ：黄色固体。ESI－MS：284［M ＋1］＋。1HNMR（500 MHz，CD3COCD3），δ：9.23（1H，s），7.79（1H，s），7.35（1H，d，J＝2.5 Hz），7.05（1H，d，J＝2.5Hz），4.02（3H，s），4.01（3H，s），2.87（3H，s）；13CNMR（125 MHz，CD3COCD3），δ：184.9（s），181.1（s），166.9（s），165.7（s），164.9（s），150.7（d），139.4（s），138.8（s），125.4（s），118.7（d），117.1（s），106.7（d），105.8（d），57.8（q），57.5（q），25.8（q）。与文献值［5］相比较，确定化合物Ⅱ为scorpinone（图1）。

图1 化合物Ⅰ和Ⅱ的结构式Fig.1 Structural formulas of compoundⅠandⅡ

2.2 抗肿瘤活性

实验发现：（1）化合物Ⅰ在测试浓度范围内对A549细胞无抑制活性；在浓度为0.1μg·mL－1、0.3 μg·mL－1、1μg·mL－1时对SK－OA－3细胞均没有抑制活性，在浓度为3μg·mL－1时对SK－OA－3细胞的抑制率为16%，在浓度为10μg·mL－1时的抑制率为65%，在浓度为30μg·mL－1时的抑制率为93%。（2）化合物Ⅱ在测试浓度范围内对A549细胞和SKOA－3细胞均没有抑制活性。

2.3 抑菌活性

实验发现：化合物Ⅰ对大肠杆菌（Escherichiacoli）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）有弱的抑制活性，在800μg时的抑菌圈直径分别为1.0cm 和1.2 cm；化合物Ⅱ在测试浓度范围内没有抑菌活性。

2.4 杀线虫活性

实验发现，化合物Ⅰ和Ⅱ均没有杀线虫活性。

3 结论

从色串孢属真菌Torulasp.YMF1.03791发酵液乙酸乙酯提取物以及菌丝的甲醇提取物中分离到2个化合物，经波谱数据分析鉴定为dehydroherbarin（Ⅰ）和scorpinone（Ⅱ）。化合物Ⅰ对宫颈癌细胞SK－OA－3有抑制活性，对大肠杆菌（E.coli）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）有弱的抑制活性，无杀线虫活性。化合物Ⅱ无抗肿瘤活性、抑菌活性和杀线虫活性。

［1］KADKOL M V，GOPALKRISHNAN K S，NARASIMHACHARI N.Isolation and characterization of naphthaquinone pigments fromTorulaherbarum（Pers.）.Herbarin and dehydroherbarin［J］.Journal of Antibiotics，1971，24（4）：245－248.

［2］NAGARAJAN R，NARASIMHACHARI N，KADKOL M V，et al.Structure of herbarin［J］.Journal of Antibiotics，1971，24（4）：249－252.

［3］NARASIMHACHARI N，GOPALKRISHNAN L S.Naphthaquinone pigments fromTorulaherbarum：Structure ofo－methylherbarin［J］.Journal of Antibiotics，1974，27（4）：283－287.

［4］耿婉丽.中国南海五角瓜参共生真菌Torulaherbarum和蓝斑背肛海兔共生真菌Chaetomiumsp.活性成分研究［D］.开封：河南大学，2012.

［5］MILJKOVIC A，MANTLE P G，WILLIAMS D J，et al.Scorpinone：A new natural azaanthraquinone produced by a bispora－like tropical fungus［J］.Journal of Natural Products，2001，64（9）：1251－1253.