芪卫颗粒对糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin表达影响的实验研究

·论著·

作者单位：100069北京,首都医科大学中医药学院[王馨瑶(硕士研究生)、耿建国、高彦彬、李娇阳(硕士研究生)、周盛楠(硕士研究生)、邹大威、刘迎新(硕士研究生)];中医络病研究北京市重点实验室[王馨瑶(硕士研究生)、耿建国、高彦彬]

芪卫颗粒对糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin表达影响的实验研究

王馨瑶耿建国高彦彬李娇阳周盛楠邹大威刘迎新

【摘要】目的探讨芪卫颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin表达的影响。方法随机选取10只健康雄性SD大鼠为正常组，其余30只采用腹腔注射大剂量链脲佐菌素(60 mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型，将成模大鼠随机分为模型组、西药组以及芪卫颗粒组，将西药组按缬沙坦10 mg/(kg·d)灌胃、芪卫颗粒组按生药10 g/(kg·d)灌胃，连续给药。于给药第24周检测大鼠血肌酐、血尿素氮及内生肌酐清除率；24周后将大鼠处死，采用PAS染色法将肾组织染色，在光镜下观察大鼠肾组织病理改变；采用western blot法检测肾组织足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin表达情况。结果与正常组相比，模型组大鼠血肌酐、血尿素氮水平显著升高，内生肌酐清除率及足细胞nephrin表达水平显著下降(P<0.05)；与模型组相比，各给药组大鼠血肌酐、血尿素氮水平明显下降，内生肌酐清除率及nephrin表达水平明显上调(P<0.05)。结论芪卫颗粒能够上调糖尿病肾病大鼠肾组织足细胞nephrin的表达，减轻足细胞损伤，保护肾功能，延缓糖尿病肾病的发生发展。

【关键词】芪卫颗粒；糖尿病肾病；足细胞；nephrin

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)(2012CB518602);国家自然科学基金面上项目(81173238)

作者简介:王馨瑶(1989- )，女，2012级在读硕士研究生。研究方向：中医药防治糖尿病及其并发症。E-mail：wangxinyao0421@aliyun.com

通讯作者：耿建国(1956- )，博士，教授，主任医师，硕士研究生导师。研究方向：中医药防治糖尿病及其并发症。E-mail：gengdoctor@sina.com.cn

【中图分类号】R285.5

收稿日期：(2014-10-20)

Influence ofQiweiGranules on the expression of nephrin in podocyte of rats with diabetic nephropathyWANGXin-yao，GENGJian-guo，GAOYan-bin，etal.CapitalMedicalUniversitySchooloftraditionalChineseMedicine,Beijing100069,China

Correspondingauthor:GENGJian-guo，E-mail:gengdoctor@sina.com.cn

Abstract【】ObjectiveThe study aims to investigate the effects of Qiwei Granules on the expression of nephrin in podocytes of rats with diabetic nephropathy (DN). Methods10 normal male SD rats were chosen randomlyas the normal group, and the other 30 rats were abdominally administered with a single injection of streptozotocin (60mg/kg) to induce DN rat models. The model rats were divided into 3 groups randomly: the model group, the western medicine group and Qiwei Granules group, Qiwei Granules group was given the prescription of Qiwei of 10 g /( kg·d), Western medicine group was given valsartan of 10 mg/( kg·d) for 24 weeks．The changes in blood urea nitrogen, serum creatinine and urinary were observed in the 24th week. After 24 weeks, all the rats were sacrificed. The pathological change of renal tissue was detected by PAS. And the expression of nephrin in podocyte was observed by western blot. ResultsCompared with normal control group, the renal function and the expression of nephrin in model groupwere significantly decreased (P<0.05). Compared with model group, the renal function and the expression of nephrin in other groups were significantly increased (P<0.05). ConclusionThe taking of Qiwei Granules could up-regulate the expression of nephrin in podocyte, decrease the damage of podocyte, and improve the renal function, which may slow the progression of DN.

【Key words】QiweiGranules;Diabetic nephropathy;Podocyte;Nephrin

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)多在糖尿病发病后5～10年发生，是导致终末期肾病发生的最主要病因。既往对DN发病机制的研究主要集中在细胞外基质的堆积、肾小球基底膜的增厚、肾间质纤维化及肾小球硬化等[1]。近年来研究发现，足细胞损伤是本病发生的中心环节[2-3]，尤以足细胞中裂孔隔膜蛋白损伤最为重要。nephrin是现今公认最重要的裂孔隔膜蛋白，当其表达异常时，足细胞结构和功能则发生异常改变，导致肾小球滤过功能减退，肾功能下降，促进DN的发生、发展[4-5]。因此，调节裂孔隔膜蛋白nephrin表达，保护足细胞，是延缓本病发生、发展的重要环节。本实验通过观察芪卫颗粒对DN大鼠肾组织足细胞nephrin表达的影响，探讨其对DN大鼠肾组织足细胞的保护作用，现将研究结果报告如下。

1材料和方法

1.1实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2试剂及药物

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma，批号：S1030)柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，0.1M，pH:4.4，批号：32J00101)。芪卫颗粒(主要成分：黄芪12 g、生地10 g、卫矛10 g、大黄6 g，由首都医科大学中药制剂室制备)。缬沙坦胶囊(北京诺华制药有限公司，批号：X1440)。Rat nephrin(Sigma,PRS2265-100UG)。

1.3主要仪器

酶标仪(北京市新风机电技术公司，ZS-3)；离心机(Sigma，3K18)；电泳仪(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DG-300C)；迷你双垂直电泳槽(北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN)；迷你转印电泳槽(北京市六一仪器厂，DYCZ-40D)；水平摇床(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，TDK-2)；超声细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所，JY92-II)；台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司，TGL-20M)。

1.4模型建立和分组给药

将40只大鼠适应性喂养1周后，依据随机数字表法分为2组：一组10只为正常组；另一组30只为造模组。造模组采用腹腔注射大剂量STZ(60 mg/kg)方法造模，三天后检测空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L视为糖尿病模型建立成功。造模成功后，随机分为三组，将西药组按缬沙坦10 mg/(kg·d)灌胃、芪卫颗粒组按生药10 g/(kg·d)灌胃；正常组及模型组予等量蒸馏水灌胃。实验期间自由饮食，连续给药24周。

1.5标本采集和检测方法

于实验第24周将大鼠断尾取血2 mL，静置20分钟左右，离心2000～3000 r/min，20分钟，分离血清进行血尿素氮、血肌酐的检测，并按照公式计算内生肌酐清除率，即内生肌酐清除率=尿肌酐×总尿量(mL/24h)/血肌酐/1440(min)/BW(g)×100，单位为mL/(min·BW/100)。于实验第24周末取材，取出肾脏去除包膜及周围结缔组织，常规制片，PAS染色法染色。用western blot检测nephrin表达情况，检测结果以β-actin作为内参，使用Quantity One软件分析；PAS染色结果在400倍镜下进行观察。

1.6统计学方法

2实验结果

2.1各组大鼠血肌酐、血尿素氮及内生肌酐清除率的比较

于给药第24周测定大鼠血肌酐、血尿素氮及内生肌酐清除率。与正常组相比，模型组及各给药组大鼠血肌酐、血尿素氮明显上升，内生肌酐清除率显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，各给药组大鼠血肌酐、血尿素氮明显下降，内生肌酐清除率显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，各给药组无统计学差异(P>0.05)，详见表1。提示芪卫颗粒能够显著改善DN大鼠肾功能。

2.2各组大鼠肾组织足细胞nephrin表达比较

于实验第24周使用western blot检测结果如下，与正常组相比，模型组大鼠足细胞nephrin表达显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，各给药组大鼠足细胞nephrin表达显著升高(P<0.05)，各给药组无统计学差异(P>0.05)，详见图1。提示芪卫颗粒可上调肾组织足细胞nephrin表达。

表1　给药24周后各组大鼠血肌酐、血尿素氮及

注：与正常组相比差异有统计学意义,aP<0.05；与模型组相比差异有统计学意义,bP<0.05

图1　给药24周各组大鼠足细胞nephrin蛋白表达 (western blot)

2.3肾组织PAS染色

光镜下可见，正常组大鼠肾组织结构无明显异常，肾小球基底膜无异常增厚；模型组大鼠肾组织系膜增生明显，细胞外基质显著增多，部分肾小球出现结节样硬化，PAS染色面积较两给药组增加；两给药组PAS染色面积较模型组明显减少，病变较模型组减轻。详见图2。

A正常组　B模型组　C西药组　D芪卫颗粒组

3讨论

近年对于DN发病机制的研究表明[6-7]：足细胞的裂孔隔膜是肾小球滤过屏障的最后一道防线，而高糖状态可直接导致足细胞损伤；当足细胞及其裂孔隔膜蛋白受到损伤时则导致蛋白尿的出现，最终导致肾小球硬化症。nephrin是第一个被发现的足细胞裂孔隔膜蛋白，也是最重要的裂孔隔膜蛋白，具有维持肾小球滤过屏障结构及功能完整性的作用[8-9]。有研究表明[10-11]：nephrin是肾小球损伤的早期指标，其表达减少直接导致了肾小球滤过功能丧失及肾功能异常。近年来国内外相关临床研究发现[12-13]：nephrin蛋白异常表达不仅与先天性肾病有关，还与多种继发性肾病相关，当nephrin表达异常时，可引起肾功能异常及大量蛋白尿的发生。因此，调节nephrin表达，减轻足细胞损伤，就成为防治DN的重要环节。

中医认为糖尿病肾病主要病机为气阴两虚，肾络瘀阻[14-15]；治疗则采用益气养阴，活血祛瘀通络之法。芪卫颗粒是高彦彬教授根据多年临床经验拟定的方剂，方中黄芪、生地益气养阴，扶助正气；卫矛、大黄活血通络，蠲除邪气，上药共奏益气养阴、活血祛瘀通络之效。前期实验研究和临床研究证实：本方具有调节转化生长因子β/Smads信号通路、降低尿蛋白，显著改善患者肾功能的作用[16-19]。

本实验研究结果也表明：芪卫颗粒能够降低大鼠血肌酐、血尿素氮，升高内生肌酐清除率，上调nephrin表达，减轻足细胞损伤，改善肾脏功能。其作用机制可能是通过上调足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin的表达，减轻DN大鼠足细胞损伤，保护肾组织，从而延缓DN的发生、发展。其详细的作用机理有待进一步研究。

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(本文编辑：蒲晓田)