乌司他丁对急性心肌梗死大鼠心脏的保护作用

李寿青，王金城，赵龙彪，申华素，陶玥江，蔚冬冬

(河北医科大学第三医院东区麻醉科，河北石家庄050035)

乌司他丁对急性心肌梗死大鼠心脏的保护作用

李寿青，王金城*，赵龙彪，申华素，陶玥江，蔚冬冬

(河北医科大学第三医院东区麻醉科，河北石家庄050035)

目的探讨乌司他丁对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心功能的影响，为术中急性心肌梗死的治疗用药提供理论依据。方法 健康雄性SD大鼠30只，随机分为假手术组、对照组和乌司他丁组，每组10只。对照组和乌司他丁组大鼠开胸心室壁穿线结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型，假手术组大鼠只开胸并在心室壁内穿线不结扎左冠状动脉前降支。对照组大鼠在术后给予腹腔注射生理盐水1 mL，乌司他丁组大鼠在术后给予腹腔注射乌司他丁8万U/kg，假手术组大鼠在术后给予腹腔注射生理盐水1 m L，3组疗程均为3 d。各组大鼠在术后均给予青霉素40万U/kg肌肉注射预防感染。每组随机选5只于术后1周取结扎部位以下心室细胞用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。其余5只大鼠于术后4周做心功能检测，检测左心室收缩压力最大变化率、左心室舒张压力最大变化率和心率。结果与假手术组比较，乌司他丁组和对照组心肌细胞凋亡率均明显增加(P＜0.01)，收缩压力最大变化率和舒张压力最大变化率明显降低(P＜0.01)，心率明显升高(P＜0.01)。乌司他丁组心肌细胞凋亡率较对照组明显降低(P＜0.01)。乌司他丁组收缩压力最大变化率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，舒张压力最大变化率与对照组比较明显升高(P＜0.01)，心率与对照组比较明显降低(P＜0.01)。结论乌司他丁对急性心肌梗死大鼠心脏有一定保护作用，可作为术中治疗急性心肌梗死、保护心脏功能的用药。

心肌梗死;乌司他丁;大鼠

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一种严重影响人类健康的疾病，可使心脏功能大大降低，是心血管疾病中一个重要的致死性疾病。乌司他丁是从人尿液中提取的蛋白酶抑制剂，可抑制多种酶的活性，对溶酶体有膜稳定性的作用，可减少心肌抑制因子的生成，通过抑制炎性介质的释放抑制炎症反应。在临床上乌司他丁最早用于急性胰腺炎的治疗，并被证实是安全有效的［1］。另外，乌司他丁还可以通过其膜稳定性作用抑制休克时溶酶体破坏释放水解酶对重要脏器产生的损害;乌司他丁的抗炎症、抗应激反应作用已被临床上用于保护重要脏器和对抗手术刺激。AMI患者术中应用乌司他丁对心脏的保护作用尚未见报道。本研究选用乌司他丁干预治疗AMI大鼠，探讨乌司他丁对AMI后心脏的作用，旨在为临床用药提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雄性SD大鼠30只(购于河北省实验动物中心)，体质量200～240 g，随机分为假手术组、对照组和乌司他丁组，每组10只。

1.2 心肌梗死模型制备［2］麻醉:腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉动物，实验中可追加0.1～0.3 mL。插入气管插管，连接小动物呼吸机(DW-3000，淮北正华生物仪器设备有限公司生产)，调节呼吸频率为90次/min，调整潮气量保证分钟通气量达到1 mL/g。备皮后消毒，暴露心脏，用事先准备的浸泡在生理盐水中的带针6.0无损伤丝线穿过心室壁并结扎左冠状动脉前降支(假手术组不结扎左冠状动脉前降支)。结扎成功后结扎部位以下心肌颜色变浅，证明结扎成功。体外结扎过程需快速不宜超过45 s。然后用0号缝合线逐层缝合关闭胸腔，关闭胸腔前预留另一套管针软管，在闭关胸腔后用注射器抽出胸腔中的空气以减小对大鼠生理状态的影响，降低大鼠术后病死率。术毕大鼠后肢肌肉注射40万U/kg青霉素预防感染。待大鼠恢复自主呼吸(没有自主呼吸的大鼠可人工按压胸部3～5次即可恢复)后，停用呼吸机，拔出气管导管。

1.3 处理方法 假手术组在术后给予腹腔注射生理盐水1 mL，对照组在术后给予腹腔注射生理盐水1 mL，乌司他丁组在术后给予腹腔注射乌司他丁(批号031208174，广东天普生化医药股份有限公司)80 000 U/kg，疗程均为3 d。

1.4 流式细胞术检测心肌细胞凋亡 术后1周大鼠称质量，麻醉后，由下腔静脉注射伊文蓝3 mL，迅速取大鼠心脏，放入生理盐水中冲洗，尽量洗净心腔中的血液和伊文蓝。大鼠心脏可见被伊文蓝染成蓝色的区域为正常心肌组织和未被染色的区域为梗死区心肌组织，剪下没有被伊文蓝染色的梗死区和梗死边缘区组织。将剪下的组织放入扎在小烧杯上的100目尼龙网上用剪刀将组织剪碎。剪到约1 mm3大小，然后用眼科镊子轻轻搓已经剪碎的组织块，边搓边加稀释的胎牛血清直到组织搓完，再用胎牛血清冲洗尼龙网，尽量冲净尼龙网以得到更多的心肌细胞。收集小烧杯中的细胞悬液，加入到试管中，再将装有细胞悬液的试管上放置离心机中离心沉淀，以1 000 r/min离心3～5 min。待离心完毕后去掉上清液，用胎牛血清冲洗吹打混匀，再将试管放置离心机上以500～800 r/min离心2～3 min。重复此操作3遍，短时离心沉淀可去除细胞碎片。按凋亡试剂盒(联科生物公司Annexin V/PI)的说明操作，上机做流式细胞凋亡检测。

1.5 大鼠心功能的测定［3］术后4周大鼠称质量，按0.3 m L/100 g剂量给予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，充分暴露大鼠颈部，行颈动脉置管，连接多导生理记录仪(Powerlab8/30，澳大利亚埃德仪器公司)，待系统自动记录2～3 min后停止测量，通过运行Chart软件分析采集数据。做完心功能的大鼠，迅速取出心脏固定，梗死及边缘区行HE染色。

1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 术后1周大鼠心肌凋亡率比较 与假手术组比较，乌司他丁组和对照组心肌细胞凋亡率均明显增加(P＜0.01);乌司他丁组心肌细胞凋亡率较对照组明显降低(P＜0.01)。见表1。

2.2 术后4周大鼠心脏功能比较 与假手术组比较，乌司他丁组和对照组收缩压力最大变化率和舒张压力最大变化率明显降低(P＜0.01)，心率明显升高(P＜0.01)。乌司他丁组收缩压力最大变化率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，舒张压力最大变化率与对照组比较明显升高(P＜0.01)，心率与对照组比较明显降低(P＜0.01)。见表1。

2.3 镜下观察 结扎线以下大鼠心肌梗死及边缘区心肌组织切片镜下观察可见假手术组大鼠心肌细胞无明显炎性细胞浸润(图1)，对照组和乌司他丁组大鼠心肌细胞则有明显炎性细胞浸润(图2，3)，但乌司他丁组大鼠梗死及边缘区炎性细胞浸润较对照组明显减少。

表1 乌司他丁对AMI模型大鼠细胞凋亡率及心脏功能的影响(n=5，±s)

表1 乌司他丁对AMI模型大鼠细胞凋亡率及心脏功能的影响(n=5，±s)

*P＜0.01与假手术组比较 #P＜0.01与对照组比较(q检验)

组别 细胞凋亡率(%) 收缩压力最大变化率(mmHg/s) 舒张压力最大变化率(mmHg/s) 心率(次/min)假手术组 4.48±2.17 6 766.47±1 184.47 6 581.62±814.69341±21对照组 43.23±4.40* 3 558.41±349.08* 3 380.85±249.90* 392±15*乌司他丁组 25.40±1.91*# 4 204.25±602.16* 4 169.17±711.54*# 360±12*#F0.000 0.000 0.000 0.000 407.172 45.760 67.695 24.605P

3 讨 论

本研究中选用乌司他丁作用于AMI大鼠，探讨乌司他丁对于AMI大鼠心肌细胞凋亡及心功能的影响。广泛应用于生物医学基础领域的流式细胞术是经荧光色素染色的细胞或细胞结构在高速流动状态下经高能激光照射，分析其发射荧光的强度和散射光，进而分析细胞功能状态，对其进行定量定性检测。本研究中用于分析梗死及边缘区心肌细胞的凋亡。

本研究结果显示，乌司他丁组大鼠与对照组大鼠比较心肌细胞凋亡率明显减少，且心功能也有了一定的提高。镜下观察大鼠梗死区及边缘区炎性细胞浸润明显减少。而这种心肌周围炎性细胞浸润的减少可能是乌司他丁发挥保护心肌细胞减少其凋亡进而提高心功能一个重要因素。乌司他丁发挥其保护心脏作用的可能机制如下:心肌梗死后可能会由炎细胞浸润、自由氧、机械应力、神经激素系统等引发细胞的凋亡。在乌司他丁对器官保护作用的研究中［4］发现乌司他丁可减少肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)髓过氧化物酶的产生。乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出的一种酸性糖蛋白水解酶抑制剂，相对分子质量为67 000，含有143个氨基酸，有2个不完全重叠的活性功能区，可同时抑制多种蛋白酶。此外，乌司他丁还作为膜稳定剂具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体膜和线粒体膜的破坏，从而抑制溶酶体酶的释放而保护组织。其还可以减少心肌抑制因子的分泌，改善微循环抗休克，减轻炎症反应，清除自由氧等功效。乌司他丁最早应用于临床是针对急性胰腺炎的治疗，在大量研究和临床探索中其在对抗手术的刺激、急性循环衰竭的治疗、器官缺血再灌注损伤的治疗等方面均有较显著的效果。这与在国内外多项研究［5-6］中报道的乌司他丁对心脏的保护作用结果相一致。乌司他丁通过其膜稳定性作用发挥稳定中性粒细胞膜作用，抑制了其毒性自由氧的释放。对线粒体膜的稳定作用也有效抑制了细胞凋亡和缺血后能量代谢的紊乱［7］。TNF-α、活性氧是增加心肌细胞凋亡的因素［8］，而 TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8和活性氧成分降低可通过影响凋亡基因的调控使凋亡抑制基因Bcl-2上调，同时下调促进凋亡基因Bax［9］，使心肌细胞凋亡减少。TNF-α、IL-6、IL-8等炎性趋化因子水平的降低使中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞向梗死区的转移，降低血管通透性，减少梗死区局部间质炎症水肿，梗死区周围因乌司他丁作用而降低的活性氧均可改善梗死区周围微循环，改善心肌顺应性，保护周围正常心肌细胞。

综上所述，乌司他丁抑制心肌抑制因子释放的功能也降低了心肌抑制因子对心肌收缩力的不良作用，进而改善心功能保护心脏。乌司他丁可以降低AMI后心肌细胞的凋亡，保护心脏功能。本研究结果提示乌司他丁可以作为术中AMI治疗保护心脏的临床用药。(本文图见封三)

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(本文编辑:赵丽洁)

R542.22

B

1007-3205(2015)02-0211-03

2014-05-15;

2014-11-20

李寿青(1987-)，女，云南昭通人，河北医科大学第三医院医学硕士研究生，从事临床麻醉学研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.034