苦参碱调节Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白表达对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

李国慧，闫　红，黄　晶，刘雪超，尹逸丛

(河北省儿童医院检验科，河北 石家庄 050031)

苦参碱调节Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白表达对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

李国慧，闫红，黄晶，刘雪超，尹逸丛

(河北省儿童医院检验科，河北 石家庄 050031)

[摘要]目的探讨苦参碱对人卵巢癌A21-2细胞株的促凋亡影响及其作用机制。方法应用浓度分别为0.8、1.0、1.2 g/L的苦参碱作用于A21-2细胞，采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期及细胞凋亡率，采用 FCM 检测Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白的表达。结果经苦参碱作用A21-2细胞72 h后，FCM分析发现，大量细胞被阻滞于G0/G1期，并形成明显的亚二倍体凋亡峰。Caspase-3蛋白、Smac蛋白表达升高(Caspase-3蛋白的荧光指数分别为2.69±0.71、3.33±0.97、4.22±1.10，Smac蛋白的荧光指数分别为2.81±0.64、3.29±0.92、3.97±0.74)，XIAP蛋白的表达降低(荧光指数分别为1.19±0.37、1.05±0.29、0.99±0.38)(P<0.01)。结论苦参碱可抑制A21-2细胞的增殖，诱导细胞凋亡。其发挥诱导凋亡的机制可能与促进Caspase-3蛋白、Smac蛋白表达，抑制XIAP蛋白表达有关。

[关键词]卵巢肿瘤；细胞凋亡；苦参碱；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.015

近年来恶性肿瘤的发病率逐年升高，严重危害了人类的生存质量。细胞凋亡是通过基因调控的细胞主动死亡过程，开发研究诱导肿瘤细胞凋亡的药物，使该药物在杀伤肿瘤细胞调亡的过程中保护机体正常组织不受损伤成为肿瘤研究工作者当前的重大课题。作为我国传统中药，苦参碱的药用价值在《本草纲目》中早有记载，苦参碱性寒味苦，具有清热利湿、退黄利尿、消炎解毒等作用，可治疗多种疾病。随着人们对中药研究的不断深入，苦参碱的抗肿瘤作用逐渐引起广大医务工作者的关注[1]。本实验通过观察苦参碱作用于肿瘤细胞后观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶激活剂(Smac)及X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的表达情况，从凋亡的角度阐述苦参碱的抗肿瘤特性，旨在为苦参碱在抗癌治疗领域提供理论依据和积累实验经验。

1资料与方法

1.1细胞培养人卵巢癌A21-2细胞保存于河北医科大学第三医院实验中心。人卵巢癌A21-2细胞用含10%胎牛血清 RPMI 1640培养基培养细胞，同时加入双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养，每1～2 d更换培养液，观察细胞生长至90%时进行细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2主要试剂苦参碱为山西泰盛药业集团产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；RPMI1640培养基为GIBCO公司产品；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自北京化工厂；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、胰酶购自石家庄拜昂生物技术有限公司；Smac、XIAP、Caspase-3鼠抗人单克隆抗体购于Santa Cruz生物技术公司。

1.3主要仪器德国PEEENDORF 5415D型台式高速离心机；德国贺利BB6220型CO2培养箱；日本OLYMPUS,CK-40 32PH倒置相差显微镜；苏净集团苏州安泰空气技术有限公司BCM-1000型生物洁净工作台；W2-2型微量振荡器(中国北京朝阳区电子仪器一厂)。

1.4实验方法

1.4.1细胞复苏从液氮中迅速取出A21-2细胞后，快速放入40 ℃左右的水浴摇床中，60 r/min，待完全融化后，无菌条件下离心，1 000 r /min，弃去冻存液，D-Hanks液洗涤1次。加入含有双抗的10%胎牛血清的培养液1 mL，将细胞转入培养瓶中，补足培养液至5 mL，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.4.2细胞传代当A21-2细胞生长至培养瓶底部大约90%时，弃去培养液，D-Hanks液洗涤2次，向瓶内加入2 mL 0.25%胰酶，轻轻摇动培养瓶，胰酶流遍所有细胞表面，然后倒掉胰酶，再加入2 mL 0.02%EDTA，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。2～3 min后将培养瓶置于显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后加入2 mL含血清培养基终止消化，用弯头吸管吸取瓶内液体，反复轻轻吹打瓶壁细胞，细胞从瓶壁上脱落后形成细胞悬液。将细胞悬液置于无菌离心管中1 000 r/min，离心10 min，弃上清，加入培养液并分别转至2个培养瓶中，补足液体继续培养。

1.4.3苦参碱作用肿瘤细胞待A21-2细胞在培养瓶中生长达到瓶底部90%时，分别加入不同浓度苦参碱(药物浓度分别为0、0.8、1.0、1.2 g/L)作用72 h，消化收集细胞制成单个细胞悬液用于实验。

1.4.4FCM检测凋亡率收集不同药物浓度作用后的A21-2细胞，PBS洗涤1次，预冷的70%乙醇4 ℃固定过夜。加入碘化丙锭(propidium iodide,PI:50 mg/L Trinton X-100 1.0%)室温避光染色30 min,用Epics-XLⅡ型流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4.5FCM检测Caspase-3、Smace及XIAP蛋白的表达A21-2细胞经不同药物浓度诱导72 h后，收集细胞，冷PBS洗2次，分别加入FITC标记的抗Caspase-3单抗、抗Smace单抗、抗XIAP单抗，阴性对照加入PBS代替，应用流式细胞仪检测荧光强度，以荧光指数表示蛋白的表达情况。

2结果

2.1检测细胞凋亡收集不同药物浓度作用72 h的A21-2细胞，与对照组比较，经苦参碱作用后的A21-2细胞，G0/G1期细胞明显增多，而S期细胞和G2/M期细胞减少(P<0.01)，在G0/G1期前有明显的亚二倍体凋亡峰形成，且细胞凋亡率随着药物浓度的增加而上升(P<0.01)，见表1。

表1药物作用后A21-2细胞周期分布及细胞凋亡率变化

Table 1A21-2 cell cycle distribution and apoptosis rate by flow cytometry after the exposure to matrine

药物浓度(g/L)细胞周期分布G0/G1SG2/M细胞凋亡率(%)0(对照)54.12±1.2317.54±0.1428.34±0.095.34±0.410.881.67±4.18*16.66±1.221.67±0.28*35.17±4.22*1.087.78±3.67*8.84±1.60*3.38±0.52*44.13±4.03*1.290.50±3.60*5.22±1.22*4.28±1.12*49.30±6.28*F233.72243.183996.64209.62P0.0000.0000.0000.000

*P<0.01与对照组比较(Dunnett-t检验)

2.2Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白的表达A21-2细胞经不同药物浓度作用72 h后，细胞内的Caspase-3、Smace蛋白表达水平增高，而XIAP蛋白表达水平下降，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2苦参碱作用后Caspase-3、Smac及

XIAP蛋白的表达

Table 2Effects of matrine on the expression

of Caspase-3,Smac and XIAP protein

药物浓度(g/L)Caspase-3SmacXIAP0(对照)1.00±0.031.22±0.391.98±0.570.82.69±0.71*2.81±0.64*1.19±0.37*1.03.33±0.97*3.29±0.92*1.05±0.29*1.24.22±1.10*3.97±0.74*0.99±0.38*F27.5527.7212.41P0.0000.0000.000

*P<0.01与对照组比较(Dunnett-t检验)

3讨论

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主死亡方式，该方式能够选择性地清除机体衰老或者损伤的细胞，是机体内重要的稳态机制之一。细胞凋亡与组织器官的发育、机体正常生理活动的维持具有密切的联系，其失常可导致多种病理情况的发生。目前细胞凋亡已经成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。随着对细胞凋亡研究的不断加深，人们发现恶性肿瘤不仅与细胞过度增殖、分化受阻有关，而且与细胞凋亡受到抑制密切相关，细胞凋亡失控是肿瘤发生的一个标志，与多种恶性肿瘤的发生和发展相关[2]。诱导细胞凋亡能够杀死肿瘤细胞而不会引起机体强烈的炎症反应，因此寻找诱导细胞凋亡的药物成为目前抗癌研究的新方向。

通过本实验发现，不同浓度苦参碱作用72 h后，A21-2细胞生长受到抑制，且细胞凋亡率随着药物浓度增加而升高，呈现良好的量效关系。

Caspase家族是参与诱导细胞凋亡的重要因素，可诱导凋亡小体的形成。在被激活前Caspase家族以无活性的形式存在于机体内，被激活后则在线粒体通路和死亡受体通路中发挥重要作用[3-4]。Caspase的活化与细胞凋亡需要两条不同的途径，而这两条途径均需要活化的Caspase-3，因此Caspase-3被认为是细胞凋亡关键蛋白酶，在细胞凋亡中处于核心位置，是细胞凋亡效应的中心分子，其高表达可引起细胞凋亡。

细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一类具有抑制细胞凋亡功能的蛋白质，在肿瘤的发展中起重要的作用[5-6]，IAP家族是Caspase家族的内源性抑制因子，利用该家族所含有的高度保守的杆状病毒IAP序列与Caspase结合而发挥凋亡抑制作用[7]。IAP家族中XIAP是具有抑制凋亡作用最强的成员，可通过结合Caspase-3而使其活性丧失，从而阻止细胞凋亡发生，多种实验研究表明，各种因素引起的XIAP下调都会增强肿瘤细胞对诱导凋亡的敏感性[8]。XIAP抑制Caspase-3活性作用被多种基因负性调控，促凋亡蛋白Smac就是其中之一[9]，Smac是凋亡抑制剂相关蛋白[10]，是一种线粒体蛋白，通过参与线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路而发挥抗肿瘤作用。可特异性结合凋亡抑制因子XIAP，解除XIAP对Caspase-3的抑制作用，释放活化的Caspase从而促进凋亡的发生[11-12]。因此，Caspase-3、Smac和XIAP在细胞凋亡的共同途径中发挥着相当重要的作用。

本研究结果显示，苦参碱作用于A21-2细胞后，Caspase-3蛋白表达随着药物浓度增加而上调，0.8、1.0、1.2 g/L苦参碱作用细胞后，其荧光指数分别为2.69±0.71、3.33±0.97、4.22±1.10，与对照组比较差异有统计学意义；Smac蛋白表达也随着药物

浓度的增加而上调；XIAP蛋白则随着药物浓度的增加下调。表明苦参碱能够抑制肿瘤细胞A21-2增殖，并且促进其凋亡，其发挥诱导凋亡作用的机制可能通过上调促凋亡蛋白Smac的表达，下调凋亡抑制蛋白XIAP的表达，从而促进Caspase-3的高表达而实现。

[参考文献]

[1]李国慧，刘瑞花，李贵霞，等.苦参碱对人骨肉瘤细胞MG63凋亡影响的实验研究[J].河北医科大学学报，2014，35(1)：53-55.

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[3]Qin S,Yang C,Li S,et al.Smac:its role in apoptosis induction and use in lung cancer diagnosis and treatment[J].Cancer Lett,2012,318(1):9-13.

[4]Sun Q,Zheng X,Zhang L,et al.Smac modulates chemosensitivity in head and neck cancer cells through the mitochondrial apopttoic pathway[J].Clin Cancer Res,2011,17(8):2361-2372.

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[8]Yang D,Zhao Y,Li AY,et al.Smac-mimetic compound SM-164 induces radiosensitization in breast cancer cells through activation of caspases and induction of apoptosis[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(1):189-199.

[9]王琼，孙湛.三七总苷对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织的凋亡抑制作用[J].现代生物医学进展，2013,13(15)：2804-2808.

[10]Emeagi PU,Thielemans K,Breckpot K,The role of SMAC mimetics in regulation of tumor cell death and immunity[J].Oncoimmunology,2012,1(6):965-967.

[11]Darding M,Feltham R,Tenev T,et al.Molecular determinants of Smac mimetic induced degradation of cIAP1 and cIAP2[J].Cell Death Differ,2011,18(8):1376-1386.

[12]Hui KK,Kanungo AK,Elia AJ,et al.Capase-3 deficiency reveals a physiologic role for Smac/DIABLO in regulating programmed cell death[J].Cell Death Differ,2011,18(11):1780-1790.

(本文编辑：许卓文)

·论著·

·论著·

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四医院主管技师，医学博士，从事输血与肿瘤免疫研究。

[中图分类号]R737.31

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)07-0800-04

[收稿日期]2015-03-23；[修回日期]2015-04-14 2015-03-15；[修回日期]2015-04-22

[基金项目]河北省科学技术研究与发展计划项目 (132777103D) 河北省医学科学研究重点课题计划(20100442)

[作者简介]亢泽坤(1968-)，男，河北石家庄人，河北医科大学第二医院副主任药师，理学学士， 从事临床药学、药物安全性研究。 赵学涛(1977-)，男，河北阜城人，河北医科大学第

Matrine regulates expression of Caspase-3,Smac and XIAP protein
to induce the apoposis of tumor cell

LI Guo-hui,YAN Hong,HUANG Jing,LIU Xue-chao,YIN Yi-cong

(Department of Clinical Laboratory,Children′s Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of matrine on the apoptosis of human ovary cancer A21-2 cells and its molecular mechanisms.MethodsA21-2 cells were treated with matrine at different concentrations(0.8,1.0,1.2 g/L).Flow cytometry method(FCM) was used to detect the apoptosis rate and cell cycle of A21-2 cells.The expression of Caspase-3,Smac and X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP) were detected by flow cytometry.ResultsAfter matrine treatment,FCM analysis indicated that the great many treated cells were blocked at G0/G1phase,at the same time,there was a typical apoptotic peak.The expression of Caspase-3 and Smac protein were up-regulated,fluorescence index of Caspase-3 was respectively 2.69±0.71,3.33±0.97,4.22±01.10,fluorescence index of Smac was 2.81±0.64,3.29±0.92,3.97±0.97.But,the expression of XIAP protein was down-regulated,fluorescence index was 1.19±0.37,1.05±0.29,0.99±0.38)(P<0.01).ConclusionMatrine can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A21-2 cells.The mechanisms of apoptosis-inducing may be associated with the up-regulation of the expression of Caspase-3,Smac and the down-regulation of XIAP.

[Key words]ovarian neoplasms;matrine;apoptosis;caspase-3