复方中药对大强度运动大鼠海马NF—κB p65、TNF—α和IL—10表达的影响

复方中药对大强度运动大鼠海马NF-κB p65、TNF-α和IL-10表达的影响

刘显斌1，吴春燕2

(1. 山东省水上运动管理中心，山东 日照276800；2. 山东省体育科学研究中心，山东 济南250012)

摘要：目的研究复方中药益气养血补肾方对长期大强度运动大鼠海马炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-10的影响，进一步探讨该中药的神经保护作用及机制。方法45只雄性SD大鼠随机分为对照组、大强度运动组和中药组，每组15只。其中，大强度运动组和中药组进行递增负荷跑台训练，时间为7周。用Western-blotting法测定海马NF-κB p65的蛋白表达水平，用ELISA法观察大鼠海马TNF-α、IL-10蛋白表达水平。结果与对照组相比，大强度运动组NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)；中药组NF-κB p65、TNF-α蛋白表达水平明显低于大强度运动组(P<0.05，P<0.01)，IL-10蛋白表达水平则明显高于大强度运动组(P<0.01)。结论：复方中药益气养血补肾方可能通过降低NF-κB p65、TNF-α表达水平抑制长期大强度运动引起的炎症反应，并通过升高IL-10表达水平促进抗炎作用，减轻缺血缺氧性脑损伤，从而发挥神经保护作用。

关键词：大强度运动；海马；NF-κB p65，TNF-α，IL-10

中图分类号：G804.7

收稿日期：2015-03-20

基金项目：国家体育总局重点研究领域攻关课题(编号：2014B058)。

作者简介：刘显斌(1971-)，男，高级教练员，研究方向运动训练与体能康复。

Effects of compound Chinese medicine on the expression of NF-κB p65, TNF-α and IL-10 in Rat Hippocampus with high intensity exercise

LIU Xian-bin1, WU Chun-yan2

(1.ShandongWaterSportsManagementCenter,Rizhao276800,Shandong,China; 2.ShandongResearchCenterofSportsScience,Jinan250102,Shandong,China)

Abstract:Objective: To study the effects of compound Chinese medicine on the expression of NF-κB p65, TNF-α and IL-10 in rat hippocampus with long-term high intensity exercise.Methods: Male SD rats were randomly divided into three groups: control group (n=15), high intensity exercise group (n=15) and Chinese medicine group (n=15). The exercise project was applied by 7 weeks treadmill at progressive increase exercise intensity．The level of protein expression of NF-κB p65 in rat hippocampus was detected by the methods of Western blotting. The levels of protein expression of TNF-α, IL-10 were determined by the methods of ELISA.Results: Compared with the control group, the levels of protein expression of NF-κB p65, TNF-α, IL-10 in high intensity exercise group were obviously increased. The levels of protein expression of NF-κB p65 and TNF-α in Chinese medicine group were significantly decreased compared with those in high intensity exercise group. The levels of protein expression of IL-10 in Chinese medicine group were obviously increased compared with those in high intensity exercise group.Conclusions:The compound Chinese medicine can inhibit inflammatory by reducing the expression of NF-κB p65 and TNF-α, and promote anti-inflammatory by increasing the expression of IL-10, so as to protect the brain from ischemia injury probably.

Key words:high intensity exercise; Hippocampus; NF-κB p65；TNF-α；IL-10

已有研究证实，大强度运动可引起机体多种炎性因子水平的变化，因而引发一系列炎性反应[1-2]。NF-κB是近年发现的一种与炎症反应密切相关的转录因子，在脑缺血性损伤后脑组织的炎症反应中扮演重要角色[3]。脑组织缺血时，NF-κB被特异性激活，通过调控肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6 (IL-6)、白介素-1( IL-1)、、白介素-10 (IL-10)等多种细胞因子和炎症介质的基因表达，参与缺血性脑损伤的病理生理过程。长期大强度运动可使机体脑部血流量下降，氧供相对不足，大量炎性细胞聚集，引发大量炎性介质和炎性细胞因子的释放，出现缺血、缺氧性损伤，从而导致神经系统功能下降。

传统的中医药在长期大强度运动导致的运动疲劳的消除方面具有独特的优势。前期研究已经证实[4]，复方中药益气养血补肾方可以通过抗氧自由基，调节神经递质水平，提高神经营养因子水平等发挥神经保护作用。本研究以炎症反应为切入点，通过建立大强度运动模型，观察长期大强度运动下大鼠海马炎性因子NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表达水平的变化，并用复方中药益气养血补肾方进行干预，从炎症反应层面进一步探讨其对运动疲劳的神经生物学机制。

1材料与方法

1.1动物分组

雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠45只，7周龄，清洁级，体重187.6±15.3g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。适应性饲养1周后，将大鼠随机分为对照组、大强度运动组和中药组，每组15只。

1.2运动模型的建立

对照组不进行任何运动训练，大强度运动组和中药组在小动物跑台上进行跑台训练。采用的运动方案参考 Bedford[5]和 Wisloff[6]的递增负荷跑台运动(并略加修改)，时间为7周(具体方案见表1)。力竭标准为：大鼠不能保持预定速度，3次以上滞留于跑道后1/3处，刺激驱赶无效。行为特点表现为神精倦怠、呼吸深大，俯卧位，对刺激反应不明显。

表1　动物训练方案(m/min×min)

1.3药物制备及给药方法

中药益气养血补肾方组成：白术、熟地、人参、川芎、茯苓、甘草、白芍、当归、补骨脂、杜仲各9g、川断、山药、牛膝各6g、肉桂3g(由山东中医药大学附属医院药房提供) ，将以上药用蒸馏水浸泡30 min，煎煮两次(30 min/次) ，过滤，合并滤液加热蒸发浓缩，制成100%浓度，4℃保存备用。

中药组每天给予益气养血补肾方水煎剂0.1ml/10mg，于运动前半小时灌胃，对照组及大强度运动组给予同体积的生理盐水，连续灌胃7周。

1.4取材

最后一次训练结束后24小时，将各组大鼠深度麻醉后快速断头，分离海马，先置于液氮罐中速冻，后-70℃超低温冰箱保存。

1.5仪器与试剂

1.5.1仪器

离心机(德国Eppendorf-5430)，低温冰箱(日本三洋MDF-382E型)，移液器(德国EPPENDORF)，恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型)，电子天平(德国Sartorius公司)，制冰机(德国AF10 SCOTSMAN)，电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.5.2试剂

NF-κB抗体(美国CST公司)，TNF-α、IL-10ELISA试剂盒，DAB显色试剂盒。

1.6指标测试

1.6.1Western-blotting法检测海马NF-κB p65蛋白表达

从-70℃超低温冰箱中每组取出5个海马组织，加入适量裂解液后置于冰上进行匀浆； 12000转离心10分钟，取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白含量并调平各组蛋白浓度；分装，-20℃冻存备用；各样本等量蛋白进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转至PVDF膜；取出转移膜置于封闭液中，室温下振摇1小时，以封闭膜上的非特异结合；封闭后的膜加入稀释的一抗工作液中，4℃ 反应过夜；TBST洗膜，10分钟×3次；洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中，室温、避光振摇60分钟；将膜取出，TBST洗涤，10分钟×3次；显色，曝光，Image J软件计算条带灰度值，计算目的蛋白和β-actin的Optical Density (OD)比值。

1.6.2ELISA法测定TNF-α、IL-10的蛋白表达

将每组剩余的10个海马组织匀浆离心后取上清液，采用ELISA法测定TNF-α、IL-10的水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.7数据统计与分析

用SPSS15.0软件对数据进行数据处理，计数资料以x±s表示，采用独立样本t检验，P<0.05 为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

2结果

2.1各组大鼠海马NF-κB p65的蛋白表达

对照组可见少量NF-κB p65表达，大强度运动NF-κB p65蛋白表达量较对照组显著升高(P<0.01)，中药组NF-κB p65蛋白表达量则明显低于大强度运动组(P<0.01)(见图1，2)。

A为对照组，B为大强度运动组，C为中药组 图1　各组大鼠海马NF-κB p65蛋白表达变化 注：△△表示，与对照组相比，P<0.01；##表示，与大强度运动组相比，P<0.01。

图2　各组大鼠海马NF-κB p65蛋白表达特点

2.2各组大鼠海马TNF-α、IL-10的蛋白表达

组别TNF-α(ng/L)IL-10(ng/L)对照组大强度运动组中药组127.86±18.54185.41±21.33△△166.97±19.64#141.23±20.66225.71±30.69△△261.62±27.53##

注：△△表示，与对照组相比，P<0.01；#表示，与大强度运动组相比，P<0.05，##表示，与大强度运动组相比，P<0.01。

3讨论

长期大强度运动作为一种对机体的过度应激，超出了机体生理机能所能承受的负荷，可对机体造成一定的损伤[7]。大强度运动引起的脑缺血缺氧性损伤可导致神经系统功能失调与障碍，是引发运动疲劳的可能机制之一。在众多的脑缺血缺氧性损伤的病理机制中，炎性细胞因子的表达和炎性细胞的浸润激活的炎症反应可加重机体组织的损伤，促进继发性脑损害发生，成为脑缺血再灌注损伤的重要组成部分和主要过程之一。

NF-κB是一种与炎症反应密切相关的转录因子，NF-κB的激活是脑缺血性损伤后脑组织的炎症反应的关键。NF-κB存在于脑血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞中，是NF-κB/Rel蛋白家族成员，由多肽p50和p65亚基形成p50-p65同源二聚体及p50-p65异源二聚体。其中发挥主要生理功能的是p50-p65异源二聚体。NF-κB未激活时与抑制蛋白IκB结合位于胞质，在某些刺激因素作用下IκB降解，并与 NF-κB解离后被激活，进入胞核与特定基因启动子结合，调控基因的转录。多种炎症递质基因的启动子和增强子中包含κB位点，如TNF-α、IL-1、IL-6等，这些因子促进炎症反应，加重脑损伤，在缺血再灌注后所引发的继发性损伤中起关键作用。

TNF-α是被激活的巨噬细胞、小胶质细胞、星型胶质细胞等细胞分泌的一种细胞因子。小胶质细胞是脑内主要的免疫细胞，在脑缺血后几分钟激活，激活的小胶质细胞可以产生TNF- α、IL-1等炎症反应因子。增多的TNF-α、 IL-1可进一步活化小胶质细胞[8]，诱导产生大量炎症介质，包括转录因子核因子NF-κB、TNF、IL 等。TNF-α 与受体 TNFRl (p55)和 TNFR2 (p75)结合后激活蛋白激酶、磷脂酶A2等胞内信使分子，也可活化细胞核内的转录因子，促进细胞粘附分子、细胞因子、COX-2及iNOS等的表达。TNF-α不仅能自身激活，而且还能促进其他多种促炎性细胞因子的合成和释放，并引起细胞因子级联反应，导致全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征等。

IL-10由Th2细胞、某些Thl细胞、单核-巨噬细胞、B细胞、肥大细胞和角质细胞等产生，是重要的抗炎细胞因子。IL-10作为一种免疫抑制因子，能够抑制活化单核细胞的促炎因子IL-lα、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和粒细胞、巨噬细胞、集落刺激因子的产生、表达。并可以通过阻断核转录因子NF-κB下调IL-1β、IL-6 等炎症因子对平滑肌细胞增殖的剌激作用，下调细胞间粘附分子的表达和活性，从而抑制TNF-α和NO，抑制白细胞的聚集，从而起到抗炎作用[9-10]。

本实验建立了长期大强度运动模型，并观察大鼠海马组织中炎性因子NF-κBp65 、TNF-α、IL-10蛋白表达水平的变化，进一步探讨运动疲劳的神经生物学机制。结果表明，大强度运动组大鼠NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表达水平均较对照组显著升高，说明长期大强度运动引起的脑缺血缺氧可同时激活促炎反应和抗炎反应。

我国传统的中医药注重辩证施治，在抗运动疲劳方面具有显著的优势。长期大强度运动引起的运动疲劳属于中医“劳倦”、“虚劳”的范畴。中医理论认为，肾藏精，主骨、生髓，为先天之本，脑为髓海。劳则伤肾，因此长期大强度运动可致肾精不足，髓海空虚。气血是人体最基本的生命物质，脑离不开气血的温煦、儒养。劳则耗伤气血等精微物质，肾精不足不能化生气血，都可导致气血亏虚，脑失濡养，引起缺血性脑损伤等病理生理过程。由此可见，长期大强度运动后引起的肾精不足，气血亏虚是运动疲劳的主要病因病机。为此，本研究选用复方中药益气养血补肾方进行干预，旨在探讨该方对运动疲劳的神经生物学机制，从而为该方药延缓或消除运动疲劳提供分子水平的理论依据。益气养血补肾方由八珍汤和肉桂、牛膝、川断、补骨脂、杜仲、山药共14味中药组成，共奏补肾益精、气血双补之效。

本研究结果表明，中药组的NF-κB p65、TNF-α蛋白表达水平较大强度运动组均显著降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10蛋白表达水平较大强度运动组显著升高(P<0.01)。因此说明，复方中药益气养血补肾方可能通过降低NF-κB p65、TNF-α表达水平抑制长期大强度运动引起的炎症反应，并通过升高IL-10表达水平促进抗炎作用，减轻缺血缺氧性脑损伤，从而发挥对脑组织及神经功能的保护作用。

综上所述，长期大强度运动导致的脑缺血缺氧可能引起NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表达增加，同时激活促炎反应和抗炎反应。复方中药益气养血补肾方可能通过降低NF-κB p65、TNF-α表达水平抑制长期大强度运动引起的炎症反应，并通过升高IL-10表达水平促进抗炎作用，减轻缺血缺氧性脑损伤，从而发挥对脑组织及神经功能的保护作用。

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