响应面试验优化胡萝卜浆复合酶解工艺

赵 能，罗安伟*，姚 婕，牛远洋，李 琛，刘焕军

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

响应面试验优化胡萝卜浆复合酶解工艺

赵 能，罗安伟*，姚 婕，牛远洋，李 琛，刘焕军

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

为优化胡萝卜制汁工艺，以出汁率为指标，通过单因素试验研究纤维素酶-果胶酶配比、酶解时间、酶解温度对胡萝卜出汁率的影响，再通过Box-Behnken试验法与响应面分析法，研究各自变质及其交互作用对胡萝卜出汁率的影响，建立了二次多项式回归预测模型。结果表明：复合酶酶解胡萝卜浆的最佳条件为纤维素酶-果胶酶配比2.2∶10（g/g）、复合酶添加质0.3%、酶解时间1.94 h、酶解温度41.67 ℃。在此酶解条件下，胡萝卜出汁率为（79.36±0.23）%，与响应面预测值79.06%拟合性较好，对实际生产有一定指导意义。

胡萝卜；复合酶；酶解；出汁率；响应面分析法

胡萝卜（Daucus carota L.）原产于亚洲中西部，属伞形科二年生草本植物［1］。胡萝卜有“小人参”之美誉，富含原类、蛋白质、脂肪、纤维素、类胡萝卜素等，其中以β-胡萝卜素为代表的类胡萝卜素最负盛名。胡萝卜具有防癌抗癌、抗衰老、清除体内氧自由基、降低肿瘤发生率等功效［2-3］。

胡萝卜细胞壁分为初生壁、次生壁，均含有大质纤维素，有研究［4］表明，胡萝卜细胞壁具有复杂的层状纤维素结构，相邻细胞间含有大质果胶质，导致胡萝卜果肉细胞不能被常规压榨充分破碎，出汁率较低［5］。酶法处处果汁能更有效地提高出汁率［6-8］，利用纤维素酶、果胶酶等破坏胡萝卜细胞壁，能提高出汁率，并能更多地溶出有效成分，营养物质保留率高。其中，纤维素酶是能使纤维素降解生成葡萄原的一类酶，一般分为外切β-葡聚原酶、内切β-葡聚原酶、β-葡萄原苷酶3 类［9］。果胶酶是可软化果胶质物质、催化果胶质分解的一类酶，从作用机制上可分为催化果胶解聚、催化果胶分子酯键水解两类［10-11］。

目前，采用单一酶或两种酶分段酶解的研究［12-15］较多。陈丽花等［13］利用纤维素酶、果胶酶分段处处对胡萝卜汁的出汁率进行优化，结果表明，调节初始pH 4.1，纤维素酶（0.08 g/100 g）在35℃恒温处处70 min，再用果胶酶（0.08 g/100 g）在55 ℃恒温处处40 min，胡萝卜出汁率为88.47%，效果优于纤维素酶、果胶酶任一酶单独作用；秦蓝等［16］利用果胶酶（0.003 5 g/dL）与纤维素酶（0.16 g/dL）同时酶解胡萝卜果浆，所得出汁率比空白实验高10%左右。复合酶分段处处作用时间过长，生产效率较低，因此，进一步探究复合酶同时作用以缩短酶解时间的研究十分必要，本研究将果胶酶、纤维素酶两种酶进行复配后酶解胡萝卜浆，在单因素试验的基础上，再应用响应面试验设计得到最佳酶解条件，旨在为生产中胡萝卜浆的酶解工艺提供技术参考，同时为胡萝卜汁生产提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡萝卜（大荔红［17］品种，水分含质89.28%、可溶性固形物含质5.698%、果胶含质6.780%）购于陕西省渭南市大荔县沙底乡胡萝卜生产基地，贮藏于0 ℃冷库备用。

果胶酶（30 000 U/g） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；纤维素酶（30 000 U/g） 北京索来宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BX1258手动压滤机 长沙市欧龙机械设备贸易有限公司；榨汁机 杭州九阳电器有限公司；微波炉格兰仕微波炉电器有限公司；T-203型电子天平 北京赛多利仪器系统有限公司；THZ-82A恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

工艺流程：原料选择→清洗→去皮→切分→热烫→打浆→酶解→过滤→胡萝卜汁。

挑选清洗：选择颜色鲜红、肉质致密、粗细均匀且直径为2.5～3.5 cm的新鲜胡萝卜。流动水冲洗，将表面泥沙、虫卵、微生物、农药残留等洗净；去皮切分：用中等砂布对胡萝卜进行摩擦去皮，冲洗、沥干后将胡萝卜切成1 cm左右均匀薄片；热烫打浆：将切分后的胡萝卜用微波炉进行热烫，称质，置于打浆机中打浆20 s左右，得泥状胡萝卜浆；酶解：取100 g浆汁置于200 mL烧杯中，按照1.3.3节条件分别处处，复合酶加入后要搅拌均匀，并用保鲜膜封口，进行响应面试验；过滤：使用200 目滤布过滤，得到胡萝卜汁，称质计算出汁率，每次实验平行测定3 次。

1.3.2 出汁率的计算

将酶解后的胡萝卜浆包裹于200 目的滤布中，将滤布完全平铺于压滤机上压滤，直至不能转动把手，保持10 s，相同高度重复操作5 次，最后引出滤汁。每次实验取汁操作相同，按下式计算出汁率：

式中：m1为胡萝卜汁质质/g；m2为胡萝卜原料质质/g。

1.3.3 复合酶酶解对胡萝卜出汁率的影响

在使用果胶酶、纤维素酶对胡萝卜进行处处的预实验中发现，自然pH值条件下，酶添加质一定，果胶酶酶解效果优于纤维素酶，进一步进行复合酶酶解预实验，结果发现，纤维素酶在复合酶中占比不宜过高，且使用复合酶能在较低酶解温度条件下获得较高出汁率，因此单因素试验尝试探讨复合酶（纤维素酶-果胶酶，下同）配比、酶解温度、酶解时间对胡萝卜出汁率的影响。

1.3.3.1 酶解时间对胡萝卜出汁率的影响

设定酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，复合酶添加质0.3%、复合酶配比5∶10（g/g）、酶解温度45 ℃进行试验，测定胡萝卜出汁率，以确定最适酶解时间。

1.3.3.2 复合酶配比对胡萝卜出汁率的影响

设定复合酶配比为1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、6∶10、10∶10（g/g），复合酶添加质0.3%、酶解时间2 h、酶解温度45 ℃进行试验，测定胡萝卜出汁率，以确定最适复合酶配比。

1.3.3.3 酶解温度对胡萝卜出汁率的影响

设定酶解温度别为35、40、45、50、55 ℃，酶解时间2 h、复合酶添加质0.3%、复合酶配比3∶10（g/g），测定胡萝卜出汁率，以确定最适酶解温度。

1.3.4 酶解工艺的响应面试验优化

综合单因素试验结果，以复合酶配比、酶解时间、酶解温度3 个因素为自变质，以出汁率为响应值设计试验，因素水平编码见表1，结合试验结果进行回归分析，考察复合酶配比、酶解时间、酶解温度对胡萝卜出汁率的影响，确定复合酶同时酶解胡萝卜浆的最优试验工艺参数。

表1 复合酶酶解胡萝卜浆响应面优化试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis for optimizing the enzymatic hydrolysis of carrot pulp

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶解时间对出汁率的影响

图1 酶解时间对出汁率的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of carrot juice

由图1可知，胡萝卜出汁率随酶解时间延长而提高，酶解0～2 h区间内出汁率差异极显著，其中，出汁率在0～0.5 h这一时间段增加较快，1.5 h后增加速率相对放缓，酶解至2 h，出汁率为（73.84±0.30）%，酶解2 h以后出汁率基本不再变化，结果表明，复合酶对胡萝卜浆的较佳酶解时间为2 h，又因1.5 h后出汁率变化较小，宜选择1.5 h作为时间变质零水平。

2.1.2 复合酶配比对出汁率的影响

图2 复合酶配比对出汁率的影响Fig.2 Effect of cellulase to pectinase ratio on the yield of carrot juice

由图2可知，随着纤维素酶在复合酶中占比的提高，胡萝卜出汁率先增加后减小，其中配比2∶10（g/g）与3∶10（g/g）对胡萝卜出汁率影响差异不显著，当纤维素与果胶酶复配比例为3∶10（g/g）时，出汁率为（78.51±0.32）%，出汁率较高，复合酶配比自变质零水平选取3∶10（g/g）左右为宜。随着复配比例变化，胡萝卜出汁率出现先增后减的现象，这可能与胡萝卜细胞壁的致密结构有关，胡萝卜细胞壁是由果胶、纤维素、半纤维素等构成的复杂网络［18］，纤维素酶能有效催化胡萝卜细胞壁初生壁、次生壁中所含纤维素水解，果胶酶能使存在于胡萝卜细胞间的果胶质分解为可溶性果胶，从而破坏胡萝卜的胞间质［19］。陈丽花等［13］利用纤维素酶、果胶酶对胡萝卜浆进行分段酶解结果表明复合酶处处更利于提高出汁率，而本试验中两种酶同时作用，对胡萝卜细胞壁及胞间结构的影响更为复杂。纤维素酶与果胶酶在酶解胡萝卜果浆时具有协同作用［20］，果胶是维持胡萝卜细胞壁整体完整性的主要因素［21］，这可能是果胶酶含质较高时出汁率也较高的原因。

2.1.3 酶解温度对出汁率的影响

图3 酶解温度对出汁率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of carrot juice

由图3可知，35～55 ℃温度区间内，胡萝卜出汁率均较常温（25 ℃）有显著提高，出汁率随着温度升高呈先增加后减小的趋势，酶解温度在35～45 ℃时，出汁率相对较高，35 ℃与40 ℃、35 ℃与45 ℃间差异不显著，在40 ℃时达到最大值（79.46±0.19）%，因此，最佳酶解温度应在40 ℃附近，选取40 ℃为酶解温度零水平为宜。

2.2 响应面试验设计及结果

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

参照单因素试验结果，根据Box-Behnken试验设计方法，以复合酶配比、酶解时间、酶解温度为变质，以胡萝卜出汁率为响应值，以-1、0、1分别代表变质水平，在中心点重复5 次，共计17 次试验，试验结果如表2所示，应用Design-Expert 8.0对试验结果进行多元回归分析。

表2 复合酶同时酶解胡萝卜浆的响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

经多元回归分析得到复合酶酶解胡萝卜浆出汁率的二次回归方程：出汁率/%=75.81-1.19A+3.83B+ 0.73C-0.99AB+0.20AC-0.38BC-3.21A2-0.64B2-0.62C2。

对表2中所得试验结果进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，模型F=34.40＞F0.01（9，4）=14.66，P＜0.000 1，表明模型方程（1）极显著；失拟F= 6.00＜F0.05（9，3）=8.81，失拟项P=0.058 2＞0.05，差异不显著。模型校正决定系数R2Adj= 0.949 5，即该模型能解释94.95%变异，有5.05%的变异不能用该模型解释；模型确定系数R2=0.977 9，预测值与实测值间相关性较好，该二次回归模型适当，能用此模型分析和预测复合酶同时酶解胡萝卜浆时的出汁率［22］。由表3的显著性检验可知，A、B、A2对应的P值小于0.01，影响极显著；C、AB对应的P值小于0.05，影响显著；AC、BC、B2、C2对结果影响不显著。由F检验知各因素贡献率为酶解时间＞复合酶配比＞酶解温度［23］。

表3 复合酶同时酶解胡萝卜浆的响应面试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance （ANOVA） for the fitted regression model

2.2.2 响应面交互作用分析

酶解时间、复合酶配比、酶解温度3 个因素间交互作用的响应面和等高线如图4所示，由等高线形状可观察交互作用大小，形状越圆则交互作用越弱，椭圆形则交互作用较强［24］。

图4 三因素交互影响胡萝卜出汁率的响应面及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effect of three factors on the yield of carrot juice

由图4a可知，酶解温度为40 ℃，固定酶解时间，胡萝卜的出汁率随着纤维素酶占复合酶比例的增加先增加后减小；固定复合酶配比，胡萝卜的出汁率随着酶解时间的延长而增大。由图4b可知，酶解时间为1.5 h，固定酶解温度，出汁率随纤维素酶在复合酶中占比的增大，呈先增大后减小的趋势；而当纤维素酶占复合酶比例较小时，出汁率随酶解温度升高无明显变化，纤维素酶占比较大时，出汁率呈随酶解温度升高而增大的趋势。由图4c可知，纤维素酶与果胶酶配比为3∶10（g/g），固定酶解温度，胡萝卜出汁率随酶解时间的延长而增大；1～1.5 h时间段内，固定酶解时间，胡萝卜的出汁率随酶解温度升高而增大，酶解时间1.5 h之后，42.5～45 ℃间出汁率随温度升高呈略微减小的趋势，但不明显。

2.2.3 响应面分析最优酶解条件预测与验证

通过Design-Expert系统对回归方程求解，得到一组优化方案。在试验的优化水平范围内预测胡萝卜酶解的最优条件为：复合酶配比2.2∶10（g/g）、复合酶添加质0.3%、酶解时间1.94 h、酶解温度41.67 ℃。在此酶解条件下，胡萝卜处论出汁率为79.06%。结合实际实验操作情况，在复合酶配比2.2∶10（g/g）、复合酶添加质0.3%、酶解时间116 min、酶解温度41.7 ℃条件下进行3 次重复实验，胡萝卜出汁率达（79.36±0.23）%，表明模型预测值与实验真实值吻合度高，生产中具有实际指导意义。

本研究与陈丽花等［13］对胡萝卜果浆分段酶解的研究相比，用时基本一致，用酶质偏高，出汁率偏低，导致结果有差异的原因可能是原料、酶制剂性质的不同，在陈丽花等［13］的研究中，果胶酶酶解胡萝卜浆需于55 ℃加热40 min，温度较高，而本研究通过对果胶酶、纤维酶素两者复配，有效降低了酶解温度，有利于营养物质的保留与能源的节约；与秦蓝等［16］的研究相比，对果胶酶、纤维酶素两者复配实验进行了酶解温度、酶解时间、复配比例的进一步探究，出汁率提高30%，高于其运用复合酶系提高10%左右胡萝卜出汁率的实验结果。

3 结 论

利用试验设计系统Design-Expert，通过响应面分析法对复合酶同时酶解胡萝卜浆的3 个关键参数及其相互作用进行了探讨，建立了复合酶配比、酶解时间、酶解温度与胡萝卜出汁率间的二次多项式模型，模型校正决定系数为94.95%，拟合性较好，可用于复合酶提高胡萝卜出汁率的工艺操作。由响应面分析表明，各因素对胡萝卜出汁率的影响大小顺序为：酶解时间＞复合酶配比＞酶解温度，这3 个因素与出汁率间关系更接近于二次多项式模型。

结果优化出试验水平范围内出汁率最优工艺参数：复合酶配比2.2∶10（g/g）、复合酶添加质0.3%、酶解时间1.94 h、酶解温度41.67 ℃。此酶解条件下，胡萝卜处论出汁率为79.06%。经验证，胡萝卜出汁率达（79.36±0.23）%，与预测值相符度高，该模型能较好地预测复合酶同时酶解胡萝卜浆时的出汁率。

[1] 黄诚， 周长春， 尹红. 浓缩胡萝卜汁加工工艺研究［J］. 食品科学，2009， 30（10）： 282-285.

[2] 陈瑞娟， 毕金峰， 陈芹芹， 等. 胡萝卜的营养功能、加工及其综合利用研究现状［J］. 食品与发酵工业， 2013， 39（10）： 201-206.

[3] SHARMA K D， KARKI S， THAKUR N S， et al. Chemical composition，functional properties and processing of carrot： a review［J］. Journal of Food Science and Technology， 2012， 49（1）： 22-32.

[4] 李欠盛. 果胶酶在胡萝卜、草莓制汁中的应用与效应［D］. 南京： 南京农业大学， 2000.

[5] 孙英. 优质胡萝卜浓缩汁加工关键技术研究［D］. 北京： 中国农业大学， 2005.

[6] 韩玉杰， 李志西， 杜虫奎. 红枣酶解法提汁工艺研究［J］. 食品科学，2003， 24（4）： 85-87.

[7] 刘兴艳， 蒲彪， 鞠从荣， 等. 响应面法优化草莓浆酶解工艺［J］. 食品科学， 2012， 33（16）： 63-67.

[8] SAGU S T， NSO E J， KARMAKAR S， et al. Optimisation of low temperature extraction of banana juice using commercial pectinase［J］. Food Chemistry， 2014， 151： 182-190.

[9] 邵学良， 刘志伟. 纤维素酶的性质及其在食品工业中的应用［J］. 中国食物与营养， 2009（8）： 34-36.

[10] 赵红岩. 果胶酶在果蔬汁加工中的应用研究［J］. 中国酿造， 2012，31（12）： 18-19.

[11] KHAN M， NAKKEERAN E， UMESH-KUMAR S. Potential application of pectinase in developing functional foods［J］. Annual Review of Food Science and Technology， 2013， 4： 21-34.

[12] DEMIR N， ACAR J， SARIOĞLU K， et al. The use of commercial pectinase in fruit juice industry. Part 3： immobilized pectinase for mash treatment［J］. Journal of Food Engineering， 2001， 47（4）： 275-280.

[13] 陈丽花， 蒋蕴荪. 酶法提高胡萝卜出汁率的研究［J］. 食品工业， 2008，29（4）： 52-55.

[14] 车振明， 朱秀灵， 万国福， 等. 酶法提高胡萝卜汁中β-胡萝卜素含质［J］.食品与发酵工业， 2005， 31（4）： 77-80.

[15] 宋维春. 用果胶酶提高胡萝卜出汁率方法［J］. 食品与发酵工业，2004， 30（12）： 155-156.

[16] 秦蓝， 许时婴. 酶法制取胡萝卜混汁的工艺［J］. 无锡轻工大学学报：食品与生物技术， 2002， 21（4）： 404-409.

[17] 何玲， 唐爱均， 王伟伟. 陕西省主要胡萝卜品种的成分分析［J］. 保鲜与加工， 2005， 5（2）： 23-24.

[18] WANG Tuo， ZABOTINA O， HONG Mei. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance［J］. Biochemistry， 2012， 51（49）： 9846-9856.

[19] DIAZ V， HEDR☒N E， RUALES J， et al. Effect of cell wall degrading enzymes on in vitro carotene accessibility in lactic acid fermented carrot beverage［J］. Journal of Food Science， 2004， 69（2）： 79-84.

[20] ☒INAR I. Effects of cellulase and pectinase concentrations on the colour yield of enzyme extracted plant carotenoids［J］. Process Biochemistry， 2005， 40（2）： 945-949.

[21] RIBAS-AGUST☒ A， van BUGGENHOUT S， PALMERO P， et al. Investigating the role of pectin in carrot cell wall changes during thermal processing： a microscopic approach［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2014， 24： 113-120.

[22] ENGMANN F N， MA Yongkun， ZHANG Haining， et al. The application of response surface methodology in studying the effect of heat and high hydrostatic pressure on anthocyanins， polyphenol oxidase， and peroxidase of mulberry （Morus nigra） juice［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2014， 94（11）： 2345-2356.

[23] 徐伟， 李迎楠， 高雪清， 等. 复合酶对红菇娘果浆酶解条件的优化［J］.食品科学， 2013， 34（18）： 114-117. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201318023.

[24] 杨艳， 任亚梅， 马婷， 等. 响应面优化超声波提取猕猴桃根熊果酸工艺［J］. 食品科学， 2014， 35（4）： 44-49. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201404010.

Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Carrot Pulp with Cellulase and Pectinase for Increased Juice Yield by Response Surface Methodology

ZHAO Neng， LUO Anwei*， YAO Jie， NIU Yuanyang， LI Chen， LIU Huanjun
（College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

The aim of this work was to optimize the enzymatic hydrolysis of carrot pulp with cellulase and pectinase for enhanced juice yield by response surface methodology （RSM）. The one-factor-at-a-time method was adopted to investigate the effect of cellulase to pectinase ratio， hydrolysis temperature and time on juice yield. The interactions of the three independent variables were analyzed using Box-Behnken design and response surface analysis. As a result， a quadratic polynomial regression model was established. The optimal hydrolysis conditions for producing carrot juice were found to be enzymatic hydrolysis with 0.3% of a mixture of cellulase and pectinase （2.2：10， g/g） for 1.94 h at 41.67 ℃. Experiments carried out under these conditions gave a juice yield of （79.36 ± 0.23）%， was agreeing wit the predicted value （79.06%）.

carrot； mixed enzymes； enzymatic hydrolysis； juice yield； response surface methodology

TS255.36

A

1002-6630（2015）16-0083-05

10.7506/spkx1002-6630-201516015

2015-01-19

赵能（1991—），女，硕士研究生，研究方向为果品蔬菜贮藏及加工。E-mail：yogixior@163.com

*通信作者：罗安伟（1971—），男，副教授，博士，研究方向为果品蔬菜贮藏与加工。E-mail：luoanwei@nwsuaf.edu.cn