基于分散液-液微萃取技术的石斛酚含量测定与分析

史 琤，蒋 蕾，马银海，涂渝娇

（昆明学院化学科学与技术系，云南 昆明 650214）

基于分散液-液微萃取技术的石斛酚含量测定与分析

史 琤，蒋 蕾，马银海，涂渝娇*

（昆明学院化学科学与技术系，云南 昆明 650214）

建立分散液-液微萃取与高效液相色谱联用技术测定石斛酚的分析方法。通过对实验条件的筛选及优化，得到最佳条件：pH 3，辅以涡旋方式进行萃取，萃取溶剂为120 ☒L正戊酸、萃取时间1 min，分散剂为曲拉通X-114、用量80 ☒L。此方法进行萃取，检出限为2.625 ☒g/L，定量限为8.74 ☒g/L，线性范围为0.10～30.00 mg/L，萃取富集倍数平均值为28.02，萃取回收率平均值为1.01。将建立的分析方法应用于实际石斛样品的测定，结果表明该方法能对石斛中的石斛酚进行高效萃取与富集，方法快速简便。

分散液-液微萃取；酚酸类物质；石斛酚；石斛

石斛酚（5-［2-（3-hydroxy-5-methoxyphenyl） ethyl］-2-methoxyphenol， gigantol）是从石斛（Dendrobii Caulis）中提取分离的一种联苄类酚性化合物［1-2］，结构如图1所示，其结构中既有活泼的酚性羟基，又有芳香性和一定的疏水性，具有广泛的药处活性［3-6］。

石斛所含化学成分多样，主要有生物碱类、联苄类、菲类、芴酮类、倍半萜类、多原类等化合物［7-10］。在前期对石斛属植物的化学成分及分析研究中，对石斛属32 种药用植物中酚类成分的分析结果表明，酚类化合物gigantol、moseatilin和moscatin在大部分种中都有分布，但含质变化差异较大［11］。在质质控制方面，中国药典仅就性状及显微鉴别方法进行描述，而在含质测定等项目下还属空白，因此基于高效液相色谱的定性、定质分析方法亟待建立，以保证石斛临床用药的安全，也为准确鉴别，合处评价石斛药材提供参考。

图1 石斛酚结构Fig.1 Chemical structure of gigantol

新型的样品萃取富集技术——分散液-液微萃取具有操作简单、快速、费用低、对环境友好、较高回收率和富集倍数等优点［12-14］。本实验采用分散液-液微萃取技术并结合目前酚类物质检测最准确快捷技术——高效液相色谱法［15-17］对常用石斛中共有的有效成分石斛酚进行鉴定和含质测定，为建立石斛的质质标准提供参考，同时也为石斛的采收、生产加工提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

曲拉通X-114、正戊酸（均为分析纯） 阿拉丁化学有限公司；石斛标品（分析纯） 中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国Merck KGaA公司。

XPN-203偏光显微镜 上海长方光学仪器有限公司；1260高相液相色谱 安捷伦科技有限公司；Lab dancer涡旋仪 德国IKA公司；DD5台式低速离心机湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱色谱条件

流动相40%乙腈（A）-60%（B）超纯水，等度洗脱；检测波长203 nm；流速1 mL/min；柱温35 ℃；运行时间：15 min。

1.2.2 溶液制备

对照品溶液的制备：精确称取0.40 mg石斛酚标准品，用2 mL色谱级甲醇溶解，配制成质质浓度为200 ☒g/mL的对照溶液，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 石斛酚萃取

取200 ☒g/mL石斛酚标准品25 ☒L于5 mL离心试管中，加入120 ☒L正戊酸，80 ☒L曲拉通X-114，用蒸馏水稀释至5 mL，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，取下层溶液定容，用针管注射器取10 ☒L进样检测。

1.2.4 实际测定的样品制备

精密称取铁皮石斛药材粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇溶液，水浴1 h （50 ℃），超声45 min，过滤，滤液即为提取液，取提取液500 ☒L于离心管中，稀释至10 mL。在按1.2.3节对石斛酚进行萃取，最终获得的溶液作为实际供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 分散液-液微萃取条件的优化

2.1.1 萃取剂种类考察

本实验选择了辛醇、正戊醇、正辛醇、壬酸、正癸醇、十一醇、十二醇、正己醇、正戊酸、正己酸等作为萃取剂进行选择，结果表明仅有正戊酸出现分层现象，即正戊酸的萃取效果好，结果见表1。

表1 萃取剂种类考察Table 1 Effects of solvent type on the extraction of gigantol

2.1.2 正戊酸用质考察

选用曲拉通X-114为分散剂，用质80 ☒L，取不同用质正戊酸根据1.2.3节方法进行萃取实验，结果表明正戊酸用质为120 ☒L萃取效果好，结果见图2。

图2 正戊酸用量对富集倍数影响Fig.2 Effect of valeric acid amount on the enrichment factor of gigantol

2.1.3 分散剂种类考察

本实验选择了AEO-9、曲拉通X-114、TMN-6、乙腈、丙酮、四氢呋喃等作为分散剂，实验结果表明曲拉通X-114的分散效果好。

2.1.4 曲拉通X-114用质考察

选用正戊酸作为萃取剂，用质120 ☒L，取不同用质曲拉通X-114根据1.2.3节进行萃取实验，结果表明曲拉通X-114用质为80 ☒L萃取效果好，结果见图3。

图3 曲拉通X-114用量对富集倍数影响Fig.3 Effect of Triton X-114 amount on the enrichment factor of gigantol

2.1.5 pH值对萃取效率的影响

本实验考察pH值范围为1～9对石斛酚萃取效率的影响，由于石斛酚为酸性，用碱性调节后无萃取效果，可能是石斛酚与碱发生中和反应。结果表明pH 3萃取效果最佳，结果见图4。

图4 pH值对富集倍数影响Fig.4 Effect of pH on the enrichment factor of gigantol

2.1.6 盐效应对萃取效率的影响

本实验考察了加盐质分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%对石斛酚萃取效率的影响。结果表明，不加盐时萃取效果好。

2.1.7 萃取方法比较

本实验采用手摇、超声及涡旋3 种方法进行萃取，萃取时间1 min，结果表明，涡旋萃取效果较其他两种好，实验结果见图5。

图5 萃取方式考察Fig.5 Comparison of different extraction techniques

本实验通过对萃取过程中影响石斛酚萃取效率的因素包括：萃取剂及用质、分散剂及用质、pH值、盐等的考察，萃取条件优化后选择萃取剂正戊酸，用质120 ☒L；分散剂选择曲拉通X-114，用质80 ☒L；pH 3、无需加盐进行萃取，富集倍数为27.94，萃取回收率为1.01。萃取前后实验结果见图6。

图6 石斛酚标品色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of gigantol standard

2.2 方法学考察

2.2.1 石斛酚标准曲线绘制

分别配制质质浓度为1、10、15、20、30 ☒g/mL的石斛酚标准品，高效液相色谱检测进样10 ☒L，作标准曲线：y=-44.673 0+121.062 7x，结果显示石斛酚质量浓度与峰面积呈良好线性关系（r＞0.99）。

2.2.2 精密度

配制质质浓度为1 ☒g/mL的石斛酚标准品，根据1.2.3节进行萃取平行实验6 组。高效液相色谱检测进样10 ☒L分析，实验结果经计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.555%。实验数据见表2。通过对多个平行样的分析检测，证明方法灵敏、准确可靠、重复性好。

表2 优化条件下1 ☒g/mL石斛酚标准品精密度值Table 2 Precision for gigantol standard （1 ☒g/mL） under optimized extraction conditions

2.2.3 实际样品测定

图7 实际样品色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of real sample

对现有铁皮石斛枫斗药材中的石斛酚含质进行了测定，实际样品色谱图如图7所示，按2.2.1节所绘制标准曲线计算石斛酚含质为5.82 ☒g/g。

3 结 论

本实验建立了基于DLPME的石斛酚萃取方法，对影响萃取效率的各因素进行优化，得到了最佳萃取条件。将建立的萃取方法与高效液相色谱法结合，对方法的精密度进行了考察，并将该方法应用于实际石斛样品的测定，结果表明该方法能对石斛中的石斛酚进行高效萃取与富集，方法快速简便。可用于石斛枫斗药材中酚酸类化学成分研究及质量控制。

[1] MIYAZAWA M， SHIMAMURA H， NAKAMURA S， et al. Antimutagenic activity of gigantol from Dendrobium nobile［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1997， 45（8）： 2849-2853.

[2] 陈晓梅， 王春兰， 杨峻山， 等. 铁皮石斛化学成分及其分析的研究进展［J］. 中国药学杂志， 2013， 48（19）： 1634-1640.

[3] 张雪， 高昊， 王乃利， 等. 金钗石斛中的酚性成分［J］. 中草药， 2006，37（5）： 652-655.

[4] NATHAN C. Inducible nitric oxide synthase： regulation subserves function［M］//The role of nitric oxide in physiology and pathophysiology. Berlin Heidelberg： Springer， 1995： 1-4.

[5] 魏小勇， 高欣欣， 顾琼， 等. 石斛酚对诱导型-氧化氮合酶的抑制活性及其机制研究［J］. 广州中医药大学学报， 2011， 28（4）： 393-395.

[6] LUO Aoxue， HE Xingjin， ZHOU Songdong， et al. Purification，composition analysis and antioxidant activity of the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl［J］. Carbohydrate Polymers， 2010，79（4）： 1014-1019.

[7] 张琳， 王继涛， 张大为， 等. 珍稀濒危药用铁皮石斛 HMGR 基因的克隆和特征分析［J］. 药学学报， 2014， 49（3）： 411-418.

[8] CHAROENRUNGRUANG S， CHANVORACHOTE P，SRITULARAK B， et al. Gigantol， a bibenzyl from Dendrobium draconis， inhibits the migratory behavior of non-small cell lung cancer cells［J］. Journal of Natural Products， 2014， 77（6）： 1359-1366.

[9] XU Junder， ZHAO Weimin， QIAN Zhengming， et al. Fast determination of five components of coumarin， alkaloids and bibenzyls in Dendrobium spp. using pressurized liquid extraction and ultraperformance liquid chromatography［J］. Journal of Separation Science，2010， 33（11）： 1580-1586.

[10] NGT B， LIU J， WONG J H， et al. Review of research on Dendrobium，a prized folk medicine［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2012， 93（5）： 1795-1803.

[11] 杨莉， 张光浓， 王峥涛， 等. HPLC测定不同采收期球花石斛中酚类成分的含质［J］. 药物分析杂志， 2008， 28（1）： 1-5.

[12] HAN Yi， JIA Xiaoyu， LIU Xinli， et al. DLLME combined with GC-MS for the determination of methylparaben， ethylparaben，propylparaben and butylparaben in beverage samples［J］. Chromatographia， 2010， 72（3/4）： 351-355.

[13] ZHAO Xinna， FU Lingyan， HU Jia， et al. Analysis of PAHs in water and fruit juice samples by DLLME combined with LC-fluorescence detection［J］. Chromatographia， 2009， 69（11/12）： 1385-1389.

[14] YOUSEFI S R， SHEMIRANI F， JAMALI M R. Determination of antimony （Ⅲ） and total antimony in aqueous samples by electrothermal atomic absorption spectrometry after dispersive liquidliquid microextraction （DLLME）［J］. Analytical Letters， 2010， 43（16）：2563-2571.

[15] 许志刚， 刘智敏， 字富庭， 等. 酚类环境雌激素的样品前处处技术研究进展［J］. 化学世界， 2012， 53（7）： 432-440.

[16] YI Yanqun， YANG Qiaohong， SU Junfang， et al. Experimental study on preclinical quality control， urgent poison and irritation of Dendrobium aurantiacum eye drops， a classⅠnew drug against diabetic cataract［J］. China Journal of Chinese Materia Medica， 2013，38（7）： 1061-1066.

[17] ZHOU Jing， XU Zhiliang， KONG Hongwei， et al. Comparison of phenolic components among different species of Dendrobium （Shihu fengdou） and determination of their active components-moscatilin and gigantol［J］. Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（6）： 566-571.

Determination of Gigantol Based on Dispersive Liquid-Liquid Microextraction

SHI Cheng， JIANG Lei， MA Yinhai， TU Yujiao*
（Department of Chemical Science and Technology， Kunming University， Kunming 650214， China）

A novel method for the determination of gigantol in Dendrobii Caulis by dispersive liquid-phase microextraction（DLPME） coupled with high performance liquid chromatography （HPLC） was developed. The optimal DLPME conditions were found to be extraction by vortexing for 1 min using 120 ☒L of valeric acid as the extraction solvent and 80 ☒L of Triton X-114 as the dispersant at pH 3， yielding an average 28.02-fold enrichment and an average recovery of 1.01 for gigantol. The proposed method exhibited a limit of detection （LOD） of 2.625 ☒g/L， a limit of quantification （LOQ） of 8.74 ☒g/L and a linear range of 0.10-30.00 mg/L. The method was successfully applied to analyze real samples， and the results showed that it was a rapid and efficient method for the extraction of gigantol in Dendrobii Caulis.

DLLME； phenolic components； gigantol； Dendrobii Caulis

O658.2

A

1002-6630（2015）16-0211-04

10.7506/spkx1002-6630-201516039

2015-04-30

昆明学院科学研究项目（XJL12015）

史琤（1963—），女，实验师，研究方向为天然产物。E-mail：kmxysz@126.com

*通信作者：涂渝娇（1978—），女，讲师，博士研究生，研究方向为天然产物。E-mail：tuyujao@163.com