IL-10、IFN-γ对儿童噬血细胞综合征的检测意义

徐智胜，郑双利，李原，曾炜炜，陈敏，钱江潮

（温州医科大学附属第二医院 儿童血液科，浙江 温州 325027）

·临 床 经 验·

IL-10、IFN-γ对儿童噬血细胞综合征的检测意义

徐智胜，郑双利，李原，曾炜炜，陈敏，钱江潮

（温州医科大学附属第二医院 儿童血液科，浙江 温州 325027）

目的：评价血清IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ对儿童噬血细胞综合征（HPS）的早期诊断及预后的价值。方法：采用前瞻性研究方法，对20例诊断为HPS患儿分成治疗前和治疗后，以20例正常体检儿童作为阴性正常对照组，再选取缓解期急性淋巴细胞白血病（ALL）18例和脓毒症患儿22例血清作为阳性对照组。通过流式细胞仪流式微球术对血清IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ水平进行测定。比较患儿治疗前后和不同分组之间血清4种细胞因子水平。结果：4种细胞因子水平随患儿HPS治疗前后明显变化，治疗前4种细胞因子水平明显高于治疗后和正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HPS患儿IL-10、IFN-γ水平较正常对照组、ALL患儿组及脓毒症患儿组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：HPS患儿IL-10和IFN-γ水平相比ALL和脓毒症患儿显著升高，可以作为儿童HPS早期诊断和预测预后的临床指标。

儿童；噬血细胞淋巴组织细胞增生症；噬血细胞综合征；细胞因子；诊断价值

噬血细胞综合征（hemophagocytic syndrome，HPS）又称噬血细胞淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）是一种单核细胞-巨噬细胞-组织细胞系统增生性疾病。目前HPS已成为严重威胁儿童生存的一种非肿瘤性疾病，以往患儿5年的生存率只有22%，通过采用国际组织细胞病协会推行免疫化疗等治疗手段已使该病的3年生存率上升至60%[1]。为了进一步提高生存率，有必要对HPS进行深入的研究，特别是HPS的早期准确的诊断，以便进行有效的治疗，而细胞因子对于HPS的早期诊断有一定的价值，有文献[2]报道HPS轻重的关键点是细胞因子释放量的多少，所以探讨细胞因子在HPS的诊断时、治疗后的变化，以期望为HPS的早期诊断、随访提供一定的依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集自2011年9月1日至2013年3月31日间我科收治诊断为HPS的患儿20例，其中男12例，女8例，年龄2个月～13岁半，中位年龄4岁，死亡1例，复发2例。全部病例均符合2004年国际组织细胞协会HPS研究小组公布的诊断标准[3]，符合以下8项中的5项：①发热；②脾大；③血细胞减少（外周血常规累及两系或三系）：血红蛋白（Hb）＜90 g/L（新生儿Hb＜100 g/L），血小板＜100×109/L，中性粒细胞＜1.0×109/L；④高甘油三酯血症和/或低纤维蛋白原血症：甘油三酯≥2.0 mmo/L或≥正常均值的3倍SD，纤维蛋白原≤1.5 g/L或≤3倍SD；⑤NK细胞活性降低或缺如；⑥血清铁蛋白≥500 mg/L；⑦可溶性CD25（即可溶性IL-2受体）升高（≥2 400 U/mL）；⑧骨髓/脾脏/淋巴结中噬血细胞现象，无恶性肿瘤的证据。正常体检儿童20例作为正常对照组，由于HPS常伴感染，且与肿瘤有一定的相关性，再收集急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患儿18例、脓毒症患儿22例的血清作为HPS患儿的对照组。对照组与正常组之间年龄和性别差异无统计学意义（P＜0.05）。

1.2 标本采集和检测方法 ①采集患儿治疗前、诱导化疗结束后、正常对照、确诊ALL及脓毒症治疗前，无菌采集外周静脉血2 mL。室温静置待血完全凝固，前提是不含任何抗凝剂等会影响结果的添加剂，然后取血清利用流式细胞仪流式微球术（cytometric bead assay，CBA）进行检测，所有严格按照试剂盒说明书操作。②穿孔素1（perforin 1，PRF1）基因突变的检测：从外周血用专门的试剂盒提取DNA，然后采用聚合酶链反应（PCR）的方式扩增PRF1基因的外显子和内含子区的片段进行筛查。外显子主要用premier 5.0软件设计5对引物，由生物公司合成PCR产物经过纯化后，采用ABI3730 DNA测序仪进行直接测序，经美国国家生物技术信息中心（NCBI）Genebank BLAST软件比对突变的位点。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理。数据以M（QR）或表示。治疗前后细胞因子水平比较采用配对样本t检验加秩和检验（Wilcoxon），HPS患儿组与正常对照组、ALL患儿组和脓毒症患儿组比较采用t检验加秩和检验（Wilcoxon）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPS患儿临床特征 所有HPS患儿均符合2004年国际组织细胞协会HPS研究小组公布的诊断标准，见表1。

2.2 HPS患儿治疗前后细胞因子水平 治疗前IL-6、IL-10、L-18及IFN-γ均显著高于治疗后水平，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

HPS患儿IL-10较正常对照、ALL及脓毒症患儿显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；IFN-γ显著高于正常对照组、ALL患儿组及脓毒症患儿组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HPS患儿组的IL-18水平较正常对照组亦有升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与HPS患儿组比，ALL患儿组IL-18有更加明显的增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.3 PRF1基因突变筛查 所有HPS患儿均进行了PRF1基因突变筛查，未发现错义突变。

3 讨论

儿童HPS是多种致病因素引起的淋巴细胞及组织细胞过度增殖、活化，从而产生大量炎性因子，引起的一种可危及生命的过度炎性反应[4]。细胞因子在HPS的发生、发展中起着非常重要的作用。HPS发病主要是由于巨噬细胞被活化的T淋巴细胞刺激后分泌超量的细胞因子，使T淋巴细胞及巨噬细胞均处于失控的活化状态所致[5]。在一定的情况下可以将HPS视为细胞因子病（cytokine disease）或者巨噬细胞激活综合征。

细胞因子IL-10是一种趋化因子（CXC），是细胞毒性T细胞分化因子及B细胞活化因子，1985年Luster等在研究IFN-γ诱发的免疫应答时从U937细胞中克隆到IL-10，能够在干扰素的刺激下能分泌，是由Th2辅助细胞产生的一种细胞因子，此外活化的B细胞、巨噬细胞、单核细胞、某些非淋巴细胞如上皮细胞、角质细胞也可以产生IL-10[6]。IL-10的受体CXCR3是一种G蛋白偶联的七亚单位穿膜受体，也是IL-10的一种选择性受体，可以诱导活化的效应细胞向特定炎症部位迁移。IL-10能趋化招募活化的T细胞及巨噬细胞等向特定炎性细胞迁移[7]。IL-10与其受体CXCR3的相互作用，对NK细胞、单核-巨噬细胞、T细胞起重要的调节作用[6]。IL-10在细胞免疫中起到重要的负调节作用，主要通过下面几种方式：①抑制巨噬细胞、T细胞分泌致炎因子如IL-1、IL-6、TNF-α和趋化因子；②抑制抗原递呈细胞（APC）表面主要组织相容性复合物-I I类分子及某些辅助分子如B7的表达，降低APC递呈抗原的能力；③通过直接或者间接抑制巨噬细胞的辅佐作用，进而抑制NK细胞、Th1的增殖活化；④抑制Th0细胞向Th1方向分化，抑制炎症细胞向炎症部位趋化。IL-10缺乏在多种自身免疫性疾病发病过程中起促进作用，如自身免疫性甲状腺炎、炎症性肠病[8]。

表1 20例HPS患儿临床表现及实验室检查

表2 HPS患儿治疗前后细胞因子水平比较[n=20，M（QR）或± s，pg/mL]

本研究结果显示，脓毒症患儿组及ALL患儿组IL-10的水平高于正常对照组，但HPS患儿组升高得更加明显。而HPS患儿组中，由于其IFN-γ的明显增高，刺激了IL-10的大量分泌进行负调节。升高的IL-10与其受体CXCR3的互相作用，既可以通过吸引细胞毒性效应细胞从而清除如IFN-γ等之类的因子，又抑制巨噬细胞的辅佐作用导致异常的致病性T细胞反应，使减少组织吞噬巨噬细胞，导致噬血细胞的增多，从而使血细胞进行性下降。因此，IL-10和IFN-γ的分泌、表达与HPS的发病机制有一定的关系。本研究也发现脓毒症患儿组及ALL患儿组IL-10升高，但与HPS患儿组比较，IL-10水平HPS患儿组是明显高于脓毒症患儿组及ALL患儿组，差异有统计学意义，因而IL-10水平异常增高相比于脓毒症患儿组及ALL患儿组对HPS患儿组的诊断意义更大，HPS治疗前IL-10水平较治疗后明显下降，差异有统计学意义，考虑IL-10水平在HPS的治疗效果及预后也有一定的指导意义。

IFN-γ主要由活化的Th细胞和NK细胞产生。促进诱导产生IFN-γ的细胞因子如Leukotrienes和IL-2；抑制其诱导产生IFN-γ的细胞因子如IL-10、cyclosporin A、dexamethasone。IFN-γ主要的生理作用是与它的受体结合后，通过蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）从而使酪氨酸磷酸化，磷酸化的产物叫做信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STATs），这种STATs与其他DNA结合蛋白而产生的复合体移到细胞的细胞核内，之后与细胞核基因的上游增强子区段结合，从而引起细胞因子的表达，产生多种细胞因子间相互作用、相互影响，产生一系列的免疫应答反应，进而导致HPS的发生。

表3 4组患儿细胞因子水平比较[M（QR）或，pg/mL]

表3 4组患儿细胞因子水平比较[M（QR）或，pg/mL]

与正常对照组比：aP＜0.05；与ALL患儿组比：bP＜0.05；与脓毒症患儿组比：cP＜0.05

有研究表明IFN-γ在HPS中发挥了非常重要的作用，而且认为IFN-γ＞30 U/mL是HPS的一个不良预后因子[9]。我们研究表明IFN-γ在HPS患儿组与正常对照组比较差异有统计学意义，提示IFN-γ水平异常增高，治疗前后差异也有统计学意义，临床提示患儿病情得到缓解，并且随之细胞因子水平也明显下降。IFN-γ水平的增高不但在HPS患儿组中是存在着，在脓毒症患儿组和ALL患儿组中也可以看到，但是HPS患儿组治疗前IFN-γ水平相较于正常对照组、ALL患儿组、脓毒症患儿组差异有统计学意义，考虑对于儿童HPS的诊断，IFN-γ水平的异常增高有一定的诊断特异性。

PRF1基因编码定位于10q21-22，其PRF蛋白包括3个外显子，编码区在外显子2及外显子3。PRF1基因突变占家族性噬血细胞综合征（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis，FHL）的20%～40%，突变率随着种族的不同而不同[9-10]。本次穿孔素PRF1基因突变的研究，结果未发现阳性病例，可能与收集的病例较少，FHL发病率低等有关系，需要我们进一步努力为FHL基因诊断和遗传咨询打下一定的基础。

我们目前研究发现血清IL-10、IFN-γ水平在HPS患儿治疗前相比其他对照组呈显著升高，治疗后病情好转时明显下降，可以作为儿童HPS的早期诊断和预测预后的一个指标。

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（本文编辑：吴彬）

IL-10, IFN-γ for the study of the significance of detecting for children with hemophagocytic syndrome

XU Zhisheng, ZHENG Shuangli, LI Yuan, ZENG Weiwei, CHEN Min, QIAN Jiangchao.
Department of Pediatric Hematology, the Second Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To evaluate serum IL-6, IL-10, IL-18, IFN-γ for the value of early diagnosis and prognosis of children with hemophagocytic syndrome. Methods: By using the method of prospective study of 20 children with a diagnosis of HPS into diagnosis before treatment and after treatment, while at the same time, with 20 cases normal physical examination children as normal control group, then choose the remission of acute lymphoblastic leukemia (ALL), 18 cases and sepsis were 22 cases of serum were chosen as positive control group. IL-6, IL-10, IL-18, IFN-γ levels were determined with fow cytometry instrument fow ball technique. Four kinds of cytokines serum levels before and after treatment between different groups were compared. Results: Four kinds of cytokines levels obriously varied with HPS before and after treatment in children, 4 kinds of cytokines during the diagnosis level was signifcantly higher than that of the normal control group after treatment (P＜0.05), children with HPS of IL-10 and level of IFN-γ obviously elevated compared with normal controls, children with acute leukemia and the cases of sepsis was signifcant difference (P＜0.05). Conclusion: Cytokines IL-10 and IFN-γ levels in children with HPS before treatment is signifcantly elevated compared with the control group, then markedly reduced for treatment, so it can be used as a children’s early diagnosis and prognosis prediction of HPS clinical indicator.

children; hemophagocytic lymphohistiocytosis; hemophagocytic syndrome; cytokines; value of diagnosis

R72

BDOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.016

2014-03-03

温州市科技局科研基金资助项目（Y20100055）。

徐智胜（1983-），男，浙江丽水人，住院医师，硕士。

钱江潮，主任医师，Email：qianjiangchao@vip. sohu.com。