桑椹果醋体外抗肿瘤活性的研究

王储炎，方 银，邓永进，桂仲争，葛远飞

（1.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥230601；2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江212003；3.安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥230061）

桑椹果醋体外抗肿瘤活性的研究

王储炎1，2，方 银2，邓永进3，桂仲争2，葛远飞1

（1.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥230601；2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江212003；3.安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥230061）

采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法来测定桑椹果醋的体外抗肿瘤效果，并进行细胞形态学观察。结果显示，桑椹果醋具有较强的抗肿瘤活性，并且随着桑椹果醋含量的增加，其抑制活性增大。细胞形态学观察结果表明，在桑椹果醋作用下，人肝癌细胞系SMMC-7721和宫颈癌细胞Hela两种肿瘤细胞均呈现数量减少、细胞膜加深变暗、成群聚在一起等不规则的生长趋势，表明桑椹果醋对两肿瘤细胞有较强的抑制作用。结果表明，桑椹果醋对Hela细胞的抑制效果强于SMMC-7721细胞。关键词：桑椹果醋；抗肿瘤；形态学观察

桑椹（Fructus mori）又名桑果，是桑科桑属植物成熟果穗的统称，桑椹形状呈椭圆或长形，一般颜色为红色或黑色，也有的桑椹果实为白色。早期桑椹为养蚕业的副产品[1]，近年来随着各地果桑品种的推广，桑椹资源也越来越多。桑椹作为药食同源的食品，中医认为桑椹药性温和，有补肝益气、养血生津、安神乌发、聪耳明目等功效，常用来治疗贫血、神经衰弱、失眠、津液缺乏、头昏目眩、便秘、头发早白、心脏病、风湿性关节炎、支气管炎等疾病[2]。现代研究认为桑椹含有丰富的生物活性物质，如脱氧野尻霉素、花青素、白藜芦醇、类黄酮、多糖、维生素等，医学证实桑椹具有降血糖、降血脂、抗衰老、增强免疫力等功效[3-4]。

桑椹果醋是以桑椹作为原料，经酒精发酵、醋酸发酵而成的营养丰富、风味优良的酸性调味品。果醋不仅在营养、风味、口感上优于传统食醋，而且富集了桑椹自身的活性物质，有效地提高了果醋的保健功能。目前对桑椹果醋的研究集中在酿造工艺和风味物质的研究方面[5-8]，关于功能特性的研究报道主要是抗氧化和降血脂方面[9-10]，而对其抗肿瘤方面少见报道。本研究采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（methyl thiazoyl terazolium，MTT）比色法来测定桑椹果醋对SMMC-7721和Hela两种肿瘤细胞的抑制情况，并进行细胞形态学观察，希望通过此研究为桑椹果醋产品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑椹由安徽省农科院蚕桑研究所提供；酿酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）：湖北安琪酵母有限公司；醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）江苏恒顺酱醋厂醋醅。

人肝癌细胞系SMMC-7721、宫颈癌细胞Hela：大连生物技术研究所。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：天津科密欧试剂公司；染色剂四甲基偶唑蓝（MTT）：美国Fluka公司；RPM I-1640培养液、胎牛血清：美国GIBCO公司；RPM I-1640培养基由1640基础培养基和10%胎牛血清组成。

1.2 仪器与设备

PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器公司；SHZ-88A往复式水浴恒温振荡器：太仓市实验设备厂；EL310型酶标仪：美国Bio-Tek公司；310型CO2培养箱：德国Thermo公司；Coulter Epics-XL流式细胞仪：美国库尔特公司；DM I4000B倒置荧光显微镜：德国Leica公司；96孔细胞培养板：上海圣纳堡生物科技开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桑椹果醋的制备

桑椹→原料处理→破碎分离→桑椹果汁→成分调整→酒精发酵→醋酸发酵→巴氏杀菌→桑椹果醋

1.3.2 操作要点

原料处理：选择7成熟的桑椹作为原料，将腐败变质的桑椹及混入杂质拣出来。

破碎分离：用果汁破碎机对桑椹进行破碎，过滤掉桑椹果渣，利用桑椹果汁进行发酵。

成分调整：包括糖、酸的调整和添加SO2。

酒精发酵[11]：将安琪酿酒活性干酵母按1∶20（g∶m L）的比例加入含有2%葡萄糖的溶液中，于40℃条件下活化15～20 min，再冷却活化1～2 h。然后桑椹果汁中接种酵母菌1%，在温度30℃的情况下，发酵6 d。

醋酸发酵：在酒精度为7.5%vol的桑椹果酒中，接种醋酸菌10%，于温度32℃、转速为160 r/min的条件下，发酵8～10 d即可。

巴氏杀菌：在70～80℃温度下，杀菌15～20 min。

桑椹果醋：酿成的果醋可溶性固形物含量16 g/L，总酸为4.98 g/100 m L[7]。

1.3.3 细胞培养

将SMMC-7721、Hela两种肿瘤细胞培养于RPM I-1640培养基中，要求箱内CO2浓度为5%，环境湿润，培养温度为37±0.5℃，48 h换液一次，约96 h传代一次[12]。

1.3.4 桑椹果醋体外抗肿瘤活性的测定

MTT比色法全名为3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法，原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，相对地死细胞无此功能，因此可通过比色法检测活细胞的数量，来验证抗肿瘤的活性。SMMC-7721细胞是引起人肝癌的恶性肿瘤细胞，其易于传代、成活率高，成为目前抗肿瘤和药物毒理学方面的主要研究对象[13-14]。Hela细胞是子宫颈癌的癌细胞，其细胞株增殖异常迅速，能够无限分裂，而且不会衰老致死[15]。因此，本试验利用MTT法检来测桑椹果醋对这两种典型细胞的抑制效果。试验步骤如下[16-19]：将对数生长期的SMMC-7721、Hela细胞分别配成浓度为1×105个/m L的细胞液，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200 μL，于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h，待SMMC-7721和Hela细胞贴壁后分别加入果醋样品0.2 μL、0.5 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL，同时将空白孔调零，无菌蒸馏水作为阴性对照，每个处理设置3个平行，然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/m L MTT 20 μL。继续孵育4 h后，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶解，室温振荡10 m in，用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值，按如下公式计算细胞生长抑制率。

式中：OD0为空白组的吸光度值，OD1为加样品组的吸光度值，OD2为阴性对照组的吸光度值。

1.3.5 细胞形态学观察

根据前期试验结果，为了更好地观察肿瘤细胞生长形态的变化，选择对SMMC-7721、Hela两种肿瘤细胞培养板中注入1.0 μL果醋样品，然后在37℃下培养24 h、48 h、72 h后，用倒置荧光显微镜进行形态学观察，同时设无样品的培养液处理组为对照组[20]。

2 结果与分析

2.1 桑椹果醋抗肿瘤活性分析

图1为桑椹果醋对SMMC-7721细胞和Hela细胞抗肿瘤活性的抑制情况。

图1 桑椹果醋对SMMC-7721细胞(A)和Hela细胞(B)的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of mulberry fruit vinegar on SMMC-7721 cell(A)and Hela cell(B)growth

由图1可知，随着桑椹果醋添加量的增大，SMMC-7721细胞和Hela细胞活性受到抑制也在逐渐增加；伴随时间的延长，桑椹果醋对两种肿瘤细胞的抑制率也在增加，同时在一定时间内，抑制率呈明显的时间剂量依赖性。当选取2.0 μL和1.5 μL果醋样品来做抗肿瘤试验时，72 h时桑椹果醋对SMMC-7721细胞的抑制率分别为61.24%和55.36%，对Hela细胞的抑制率则分别达到71.03%和59.62%。从细胞抑制率大小比较可看出，果醋对Hela细胞的抑制率稍高于SMMC-7721细胞。

2.2 果醋作用后细胞形态差异

图2 桑椹果醋不同作用时间下的SMMC-7721细胞形态Fig.2 Morphology of SMMC-7721 cells treated by mulberry fruit vinegar under different time

图3 桑椹果醋不同作用时间下的Hela细胞形态比较Fig.3 Morphology of Hela cells treated by mulberry fruit vinegar under different time

桑椹果醋作用前后SMMC-7721细胞和Hela细胞的形态变化情况分别见图2和图3。由图2和图3可知，倒置显微镜下观察，两种肿瘤细胞空白组生长良好，且呈梭形贴壁生长，大小均一，细胞分裂生长较快，比较透明，而且随着时间延长，细胞长势越好，72 h时肿瘤细胞密度大，基本布满了整个培养板。相比在1.0 μL果醋作用下，用药组细胞增殖缓慢，细胞膜加深、变暗，细胞呈现不规则的生长趋势，大部分细胞为了存活，成群地聚合在一起，尤其72 h时肿瘤细胞的生长态势明显差于空白组，说明桑椹果醋对肿瘤细胞有一定的抑制作用，严重影响其增长繁殖。

3 结论

试验结果证实，桑椹果醋对SMMC-7721细胞和Hela细胞具有较强的抑制作用，且随着果醋添加量的增加或作用时间的延长，其抑制率随之增加。形态学观察表明，在桑椹果醋的作用下，SMMC-7721和Hela两种肿瘤细胞均呈现数量减少、细胞膜加深变暗、成群聚在一起等不规则的生长趋势，伴随时间的延长，个别细胞甚至融合在一起，这些体现了桑椹果醋能够抑制这两种肿瘤细胞的生长，干扰其增长繁殖，因而起到抑制作用。但是，桑椹果醋为什么会对肿瘤细胞有如此强的抑制作用，其抑制机理和量效关系如何，值得进一步研究。本试验结果对于桑椹果醋产品的开发将会有非常积极的现实意义。

[1]陈祖满.桑椹酒人工发酵过程中化学成分变化的研究[J].中国酿造，2010，29（8）：139-141.

[2]吴祖芳，翁佩芳.桑椹的营养组分与功能特性分析[J].中国食品学报，2005，5（3）：102-107.

[3]王储炎，范涛，桂仲争，等.桑椹食品的开发探讨[J].食品工业，2011，32（3）：85-98.

[4]伍娟霞，董文宾，黄科，等.桑椹的营养成分及在食品加工中的应用[J].食品科技，2013，38（12）：68-71.

[5]汪建国，汪琦.桑椹保健食醋的开发与研制[J].中国酿造，2005，24（12）：58-59.

[6]王储炎，范涛，桂仲争，等.桑椹果醋风味物质的GC/MS分析[J].中国调味品，2013，38（4）：108-113.

[7]邓娜娜，马永昆，张龙，等.不同杀菌处理桑椹果醋香气质量的主成分分析[J].食品与发酵工业，2014，40（4）：172-177.

[8]吴继军，徐玉娟，肖更生，等.桑果醋挥发性成分的顶空固相微萃取-气质联用分析[J].中国酿造，2009，28（2）：148-149.

[9]张粉艳，赵炳鑫，李志西，等.桑椹醋自回淋发酵生产工艺及其DPPH清除能力研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2007，35（10）：183-188.

[10]张学良，李志西，邵东燕，等.绿茶桑椹醋饮料的研制及其减肥试验研究[J].西北农业学报，2008，17（2）：293-296.

[11]全亮，刘芳，胡彪，等.苹果甘薯复合果粮醋发酵工艺研究[J].中国酿造，2010，29（4）：170-172.

[12]陶美华，陈玉婵，李冬利，等.针层孔菌（Phellinus sp.）P11提取物体外抗肿瘤活性研究[J].中药材，2011，34（8）：1260-1263.

[13]ZHANG A L,LI J,WANG Y Q,et al.Aquaporin 1 facilitated hepatocellular carcinoma SMMC7221 cell migration associated with water permeability[J].Chem Res Chinese U,2011,27(1):99-103.

[14]LI L M FENG X C,YANG H,et al.Expression of aquaporin-1 in SMMC-7221 liver carcinoma cells promotes cell migration[J].Chinese Sci Bull,2006,51(20):2466-2471.

[15]DÜRST M,GISSMANN L,IKENBERG H,et al.A papillomavirus DNA from a cervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samplesfrom different geographic regions[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1983,80(12):3812-3815.

[16]王林美，叶博，赵振军，等.独角莲抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究[J].沈阳农业大学学报，2009，40（2）：174-177.

[17]李丽静，张亚杰，刘佳，等.人参果总皂苷抗肿瘤活性研究[J].中国中医基础医学杂志，2012，18（9）：989-991.

[18]娄德帅，范涛，王储炎，等.全蚕粉中1-脱氧野尻霉素的提取分离及分离物对肿瘤细胞的抑制作用[J].蚕业科学，2010，36（1）：109-114.

[19]杨琳，李善俊.MTT法检测蕲艾鞣酸体外抗肿瘤的活性[J].中国民康医学，2013，25（8）：1-3.

[20]黄素培.康艾注射液和苦参素注射液对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用[J].中国医院用药评价与分析，2012，12（8）：712-715.

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In vitro antitumor activity of mulberry fruit vinegar

WANG Chuyan1,2,FANG Yin2,DENG Yongjin3,GUI Zhongzheng2,GE Yuanfei1
(1.Department of Biological and Environmental Engineering,Hefei University,Hefei 230601,China; 2.Sericultrual Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhenjiang 212003,China; 3.Sericultural Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230061,China)

The in vitro antitumor activity of mulberry fruit vinegar was investigated by MTT method,and the morphology of cells was observed.The results indicated that mulberry fruit vinegar possessed higher antitumor activity,and the inhibitory activity heightened with the increase of mulberry vinegar concentration.The morphological observation results indicated that under the effect of mulberry fruit vinegar,both SMMC-7721 cells and Hela cells were decreased and clustered together,cell membrane was deepened,dimmed and presented irregular development trend.The com parison showed that mulberry fruit vinegar had stronger inhibitory effect on Hela cells than SMCC-7721 cells.

mulberry fruit vinegar;antitumor activity;morphological observation

TS264.22

A

0254-5071（2015）03-0098-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.023

2015-03-09

合肥学院人才科研基金项目（14RC03）；2014年中德学者短期合作交流项目（[2014]842）

王储炎（1982-），男，讲师，博士，主要从事食品加工的教学科研工作。