糖类化合物在两性离子亲水作用色谱柱上的保留行为评价

姜 舸， 沈爱金， 郭志谋， 李秀玲 ， 梁鑫淼

（中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，辽宁 大连116023）

亲水作用色谱（HILIC）的概念是由Alpert［1］于1990 年提出的。HILIC 采用亲水的极性材料为固定相，水-有机相为流动相。HILIC 与正相色谱类似，对强极性的化合物有很强的保留。HILIC 的固定相上键合不同的基团，能表现出不同的保留机制，通过改变流动相中水-有机相的比例，就可以分离不同极性的化合物［2］。反相色谱常用C18 为固定相，糖类等强极性化合物在反相色谱固定相上很难保留，HILIC 是反相色谱的有效补充，与反相色谱有很好的正交性［3］。

糖类化合物的色谱分析对于深入研究其结构表征和生物活性具有重要意义［4］。糖类化合物是含有多羟基的强极性化合物，在反相色谱上基本不保留，在正相色谱非极性流动相中溶解度低，HILIC 可以解决这些问题［4-8］。Click TE-Cys 是我们课题组合成的一种两性离子材料，其结构特点是硅胶表面键合了半胱氨酸。不同于传统的HILIC 材料，两性离子材料同时存在正电荷中心和负电荷中心，具有很好的亲水性［9］，Click TE-Cys 材料上电荷相反的离子平行键合在硅胶表面，因此亲水性强，分离极性化合物的能力强［10，11］。Click TE-Cys 材料用于糖类分析的保留机理的研究尚无报道。本文考察了糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上液相色谱参数对其保留的影响，并采用保留方程ln k ＝a＋bln CB＋cCB对其保留行为和保留规律进行了定量描述。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱系统包括2695 梯度泵、自动进样器、柱恒温系统、2424 蒸发光散射检测器（ELSD）和Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）。色谱柱：Click TE-Cys 色谱柱（150 mm×4.6 mm，材料颗粒直径为5 μm，自制）。

9 种糖类化合物标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司。其中木糖（xylose）、甘露糖（mannose）、半乳糖（galactose）和唾液酸（sialic acid）是单糖，蔗糖（sucrose）、麦芽糖（maltose）、乳糖（lactose）是二糖，松三糖（melizitose）和棉籽糖（raffinose）是三糖。乙腈（HPLC 级，德国Merck 公司），甲酸铵（纯度99%，J＆K 中国公司），Milli-Q 超纯水系统（Millipore 公司）。

9 种糖类化合物标准品分别用50% （体积分数）的甲醇／水溶液溶解，配制成1 g／L 的溶液和混合标准溶液备用。

称取12.6 g 甲酸铵固体溶入1 L 水中，用甲酸将其pH 值调至3.35，配制成0.2 mol／L 的甲酸铵缓冲溶液。

1.2 实验条件

高效液相色谱流动相：A 相为乙腈，B 相为水，C相为甲酸铵缓冲溶液。流速：1.0 mL／min；柱温：30℃；检测器：ELSD；吹扫氮气压力：2.069×105Pa，漂移管温度：75 ℃，增益值：80。

考察流动相中有机相比例对化合物保留行为的影响时，A 相的体积比依次为85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50% 和40%，C 相的体积比为2.5%。考察缓冲盐对化合物保留行为的影响时，A 相的体积比为73%，C 相的体积比依次为0、2.5%、5%、10%、15% 和20%，C 相体积比为0 时，流动相pH 值调至3.35。每组试验重复两次。

保留因子k ＝（tR-t0）／t0，其中，tR为溶质保留时间，t0为死时间。进样0.5 μL 甲苯，用100% 乙腈作流动相得到甲苯的保留时间即为t0。试验测得Click TE-Cys 色谱柱的死时间t0为2.600 min。

2 结果与讨论

2.1 水相比例变化对糖类化合物在Click TE-Cys色谱柱上保留行为的影响

本文选择了9 种糖类化合物标准品作为研究对象，考察了流动相参数变化对其保留行为的影响。9种糖类化合物的结构如图1 所示。

HILIC 保留行为受到多种参数的影响。除了固定相的化学性质，HILIC 中流动相的组成对极性化合物的保留和选择性也有很大影响［12-14］。本文主要考察了流动相中水相比例和盐浓度对糖类化合物保留行为的影响。

傅青等［2］考察了流动相中甲醇、丙酮和乙腈对糖类化合物在亲水作用色谱下保留行为的影响；韩超等［15］考察了流动相中甲醇、乙醇、四氢呋喃和乙腈在亲水作用色谱下对强极性化合物保留的影响。结果均表明乙腈更适合作为HILIC 流动相中的有机相。因此，本文选用乙腈-水体系作为HILIC 流动相体系。

首先考察了在70% 乙腈条件下9 种糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上的保留时间。从图2可以看出，极性最小的单糖最先被洗脱，二糖其次，极性最强的三糖最后被洗脱。

图1 9 种糖类化合物的结构示意图Fig.1 Structures of the nine carbohydrates

图2 9 种糖类化合物标准品在Click TE-Cys色谱柱上的分离谱图Fig.2 Chromatogram of the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column

接着考察了流动相中水相比例变化对糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上保留时间的影响。由图3 可知，随着水相比例的增加，溶质的保留时间减少。在酸性条件下，除了唾液酸之外的糖类化合物的ln k（k 表示化合物的保留因子）与ln CB（CB表示水相的体积分数）都呈线性关系。甲酸铵的pH值为3.35，在此条件下，Click TE-Cys 材料带正电［11］，而中性糖不带电，只有亲水作用。唾液酸的pKa 值为2.6，唾液酸带负电，唾液酸和Click TECys 材料既有静电吸引作用又有亲水作用，故唾液酸在Click TE-Cys 色谱柱上的保留比中性单糖强。由于唾液酸在Click TE-Cys 材料上受多种作用的影响，因此唾液酸的ln k 与ln CB不呈线性关系。

图3 9 种糖类化合物标准品在Click TE-Cys 色谱柱上的保留因子（k）随流动相中水相比例（CB）变化的曲线Fig.3 Plots of retention factor（k）versus water content（CB）in mobile phase for the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column

本文研究结果表明，糖类化合物在Click TECys 色谱柱上按照极性由弱到强的顺序依次洗脱，具有亲水色谱的保留特点。

2.2 盐浓度变化对糖类化合物在Click TE-Cys色谱柱上保留行为的影响

HILIC 的极性固定相与带电荷的溶质之间会发生静电相互作用，导致色谱峰拖尾或变宽，影响溶质在HILIC 色谱柱上的保留时间和选择性［16-18］。因此常在流动相中添加一定浓度的缓冲盐，用来调节样品的保留时间和峰形［2］。本文考察了不同浓度甲酸铵条件下糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上的保留时间的变化趋势。从图4 可以看出，当流动相中没有盐时（pH ＝3.35），唾液酸和Click TECys 材料之间有静电吸引作用。当甲酸铵的浓度为10 mmol／L 时，Click TE-Cys 材料带正电［11］，中性糖不带电，唾液酸pKa ＝2.6，带负电。由于流动相中的甲酸铵屏蔽了材料对唾液酸的静电吸引作用，所以唾液酸和Click TE-Cys 材料之间的静电吸引作用减弱，因此保留变弱。随着盐浓度的增加，除唾液酸之外的糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上的保留时间增加。这是由于HILIC 的流动相中水相比例低，缓冲盐会转移到固定相表面吸附的水相中，增加了水层的厚度和极性，溶质在水相中的分配系数增大，因此溶质保留时间增加［1，13］。

图4 9 种糖类化合物标准品在Click TE-Cys 色谱柱上的保留因子（k）随流动相中盐浓度（Csalt）变化的曲线Fig.4 Plots of retention factor （k）versus salt concentration （Csalt）in mobile phase for the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column

2.3 糖类化合物在亲水作用色谱模式下的保留方程

糖类化合物在HILIC 模式下的保留受多种作用的影响，如果符合分配机理，则ln k 与CB（流动相中水相的体积分数）呈线性关系［19］；如果符合吸附机理，则ln k 与ln CB呈线性关系［20，21］。

从图3 可以看出，根据吸附机理绘制的曲线，线性关系较好。根据吸附机理保留方程ln k ＝a ＋bln CB计算出a、b 值，判定系数达到0.900。其中，参数a 与溶质和固定相之间的相互作用能、溶质和流动相之间的相互作用能及溶质分子体积相关；参数b 与固定相表面的溶质分子顶替流动相中强洗脱相的分子数量相关。

本文应用卢佩章等［22］提出的顶替-吸附液相色谱相互作用模型研究了糖类化合物在Click TE-Cys色谱柱上的保留行为，流动相中的强洗脱相和保留因子的关系如下：ln k ＝a＋bln CB＋cCB，其中，参数a与参数b 的意义与吸附机理保留方程ln k ＝a ＋bln CB中的a、b 相同；参数c 与流动相的作用能相关。用回归方程ln k ＝a＋bln CB＋cCB对9 种糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上的保留值进行多元线性回归，可得到a、b、c 参数值，且判定系数R2多数都大于0.999（见表1）。结果表明可以用顶替-吸附液相色谱相互作用模型描述糖类化合物在Click TE-Cys 色谱柱上的保留行为。

表1 9 种糖类化合物标准品在Click TE-Cys色谱柱上的回归结果*Table 1 Regression Results of the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column*

3 结论

本文以9 种糖类化合物标准品为样品系统评价了糖类化合物在两性离子HILIC 色谱柱Click TECys 上的保留行为，考察了有机相比例和盐浓度对保留行为的影响，结果表明糖类化合物在Click TECys 色谱柱上的保留行为符合HILIC 的保留规律。采用顶替-吸附液相色谱相互作用模型对糖类化合物在上述HILIC 柱系统条件下的保留行为进行描述，其保留行为符合回归方程ln k ＝a＋bln CB＋cCB，该结果有助于亲水作用色谱材料的系统评价和评价方法的建立。

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