超高效液相色谱-串联质谱法同时测定制药废水中10 种抗生素

邱盼子， 郭欣妍， 王 娜* ， 孔祥吉， 何 华

（1. 环境保护部南京环境科学研究所，江苏 南京210042；2. 中国药科大学理学院，江苏 南京211198）

随着我国抗生素产品国际竞争力的不断增强，抗生素药物的年产量大大增加，生产过程中所产生的制药废水量也逐年增加。实际生产中，制药废水的处理多采用以生物处理为主、结合物化处理工艺的常规废水处理工艺。然而，现有的废水处理技术不能将其中残留的抗生素完全去除，大部分抗生素会经不同途径对土壤和水体造成污染［1，2］。

由于抗生素环境污染存在隐蔽性与长效性的特点，针对抗生素的环境管理一直处于盲区，致使抗生素的环境污染持续处于加重的态势［3］，严重影响了抗生素生产的社会效益与经济利益。制药厂废水处理工艺能否有效去除抗生素，对抗生素污染的源头控制起着重大作用。目前，大环内酯类（MLs）、氨基糖苷类（AGs）及氟喹诺酮类（FQNs）抗生素是我国医药、畜牧和水产养殖业应用广泛的几类抗生素［4-7］，在我国产量巨大。本研究所选取的10 种抗生素一般作为人用抗生素，环境暴露少，制药废水是环境中这些抗生素的主要来源之一，对公众健康和环境安全构成了严重威胁。因此建立制药废水中此类物质的分析测定方法，可为进一步研究其在制药厂废水处理系统中的消解动态提供技术支持。

液相色谱-串联质谱法是检测环境样品中抗生素含量的一种重要方法，其灵敏度高，特异选择性好，抗背景干扰能力强，能对含量低的样品进行很好的定量分析检测［8，9］。但由于氨基糖苷类抗生素极性大，且为离子型化合物，很难保留在反相色谱柱上。因此多在流动相中添加一定浓度的七氟丁酸（HFBA），通过与被测物形成离子对增强其色谱保留［10，11］。但HFBA 会在质谱中积累而污染质谱，影响仪器的灵敏度，不利于仪器后续的稳定使用。本研究以甲酸代替七氟丁酸，使氨基糖苷类抗生素获得了较好的峰形和较高的响应，并利用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（SPE-UPLC-MS／MS）技术，建立了制药废水中10 种目标抗生素的高灵敏检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱仪（LC 为Agilent Technologies 的1290 Infinity，MS 为美国AB 公司的SCIEX QTRAP 4500）；Agilent C18 色谱柱（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）（美国Agilent 公司）；真空冷冻干燥机（Benchtop K，Virtis，美国）；高速冷冻离心机（CR22GII，Sigma，德国）；Milli-Q 超纯水器（Millipore，美国）；AG-285 电子天平（Mettler，瑞士）；MG-2200 氮吹仪（EYELA，日本）；12 通道固相萃取装置（Waters，美国）；Waters Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL，粒径为30 μm，亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附）；Waters Oasis WCX 固相萃取柱（150 mg，6 mL，粒径为30 μm，混合型弱阳离子交换反相吸附剂）；Waters Oasis MCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL，粒径为30 μm，混合型阳离子交换反相吸附剂）；Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，粒径为30 μm，混合型弱阴离子交换反相吸附剂）（Waters，美国）。

乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯（Merck，德国）；试验用水为经Milli-Q 净化系统（0.22 μm 孔径过滤膜）处理的超纯水。

1.2 供试药品

标准品：巴龙霉素（paromomycin，PAR，纯度99.0%），核 糖 霉 素（ribostamycin，RI，纯 度99.0%），依替米星（etimicin，ET，纯度99.0%），奈替米星（netilmicin，NE，纯度99.0%），西索霉素（sisomicin，SI，纯度99.0%），小诺霉素（micronomicin，MI，纯度99.0%），巴洛沙星（balofloxacin，BA，纯度99.0%），帕珠沙星（pazufloxacin，PA，纯度99.0%），螺旋霉素（spiramycin，SP，纯度99.0%），氟罗沙星（fleroxacin，FL，纯度99.0%）。抗生素标准品均购于德国Dr. Ehrenstorfer 公司。10 种目标抗生素的化学结构见图1。

3 种氟喹诺酮类抗生素和螺旋霉素用甲醇配制成为1000 mg／L 的标准储备液，6 种氨基糖苷类药物因难溶于有机试剂而使用20% （v／v）的乙腈水溶液配制成为1000 mg／L 的标准储备液，储存于4 ℃的冰箱中。用甲醇配制上述10 种抗生素的混合标准溶液，质量浓度为10 mg／L。

1.3 采样方法

图1 10 种抗生素的化学结构式Fig.1 Chemical structures of the ten antibiotics

废水水样取自江苏省某药厂污水处理系统。采样在2014 年11 月3、12、20、29 日进行，每天采样3次，每8 h 采样1 次，每次从各采样点取样1 L。所采集的废水为混合水样，包括原水、调节池水、厌氧塔水、水解池水、好氧池水、二沉池水、混凝池水、最终出水，全部水样盛装于洁净的棕色玻璃采样瓶内，防止样品发生光解作用导致测定结果不准。尽快运回实验室并保存于4 ℃的冰箱内，保持样品的原始状态。48 h 内完成废水中残留抗生素的分析测定。

1.4 样品处理

准确量取经0.45 μm 玻璃纤维滤膜过滤的水样250 mL，用甲酸调节pH 为3.0 ～4.0，使目标抗生素完全离子化，利于其被固相吸附剂完全吸附保留。预先依次用6 mL 甲醇、6 mL 超纯水淋洗活化WCX 固相萃取柱。样品溶液上柱时控制流速为3～5 mL／min。过柱完成后，用6 mL 超纯水冲洗WCX 柱，最大程度除去柱内残留干扰物。抽真空30 min，尽量去除柱中残留水分。最后以10 mL 含5% （v／v）甲酸的甲醇溶液分3 次洗脱，收集洗脱液并在室温下用N2吹至近干，用乙腈-0.2% （v／v）甲酸水溶液（1 ∶9，v／v）定容至1 mL，涡旋振荡2 ～3 min，10 000 r／min 下离心10 min，取上清液待分析。

1.5 UPLC-MS／MS 测定

1.5.1 质谱条件

采用电喷雾离子（ESI）源正电离模式、多反应监测（MRM）扫描。气帘气（curtain gas，CUR）压力为206 851.8 Pa，喷雾气（ion source gas 1，GS1）压力为241 327.1 Pa，辅助加热气（ion source gas 2，GS2）压力为275 802.4 Pa，源温度（temperature，TEM）为450 ℃，离子化电压（ion spray voltage，IS）为5 500 V，碰撞气（collision gas，CAD）压力为41 370.36 Pa。其他参数见表1。

表1 目标抗生素主要的MRM MS 参数Table 1 MRM MS parameters for the target antibiotics

1.5.2 色谱条件

柱温：35 ℃；流动相：（A）0.2% （v／v）甲酸水溶液和（B）乙腈，流速0.2 mL／min；进样量：5 μL；流动相梯度：0.01 ～7.00 min，90% A ～60% A；7.01～8.00 min，90% A。

1.6 分析方法的质量控制

采用全程空白和平行样对分析过程进行质量控制，确保结果的可靠性。处理数据时，采用标准添加法对各目标抗生素在制药废水基质中存在的不可忽略的基质效应进行校正。环境样品中可能存在复杂或未知组分的基质影响，标准添加法是降低基质效应影响的有效措施。将1.4 节处理的水样平均分成两份。其中一份直接进样分析，记录待测样品的峰面积；另一份根据第一份的检出情况，精密加入适量各目标化合物标准混合工作液，然后进样分析，记录待测样品的峰面积。依据标准添加法校正公式C ＝S×Rx／（Rs-Rx）计算样品浓度。其中C 为校正后的待测物浓度；S 为标准添加量；Rx和Rs分别为标准溶液添加前、后测得的待测样品峰面积。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

氨基糖苷类抗生素（AGs）分子结构中含有多个伯氨和仲氨基团，呈碱性，极性强。为提高AGs 在反相色谱柱上的保留能力，多使用包括戊基、庚基或己基磺酸盐的离子对试剂［11，12］。由于磺酸盐难挥发，不适合质谱分析，因此一般采用易挥发的七氟丁酸作为离子对试剂［13，14］。但七氟丁酸阴离子容易和溶液中的阳离子形成紧密的中性离子对，不能被质谱检出，且会在质谱中累积，污染质谱，抑制电喷雾质谱信号而影响检测的灵敏度。本文以甲酸代替七氟丁酸，使AGs 获得了较高的响应和较好的峰形。此外，考虑到螺旋霉素在强酸性条件下容易水解，故水相选择0.2% （v／v）的甲酸水溶液。目标抗生素的色谱图如图2 所示。

2.1.2 质谱条件的优化

Agilent 1290 超高效液相色谱和AB SCIEX QTRAP 4500 联用能够提供MRM 模式，提高仪器灵敏度。将所研究的10 种目标抗生素分别配制成100 ～1 000 μg／L 的标准溶液，直接注入质谱仪，进样速度为7 μL／min，根据目标抗生素的分子结构特征，在正离子模式下对目标抗生素实行半自动进样，采用一级质谱对目标物进行母离子全扫描，分析得到［M＋H］＋分子离子峰，然后二级质谱以分子离子为母离子，优化CE、DP、EP、CXP 等4 个参数，对各目标抗生素的子离子进行全扫描，选信噪比较高的两个子离子与分子离子组成定性和定量离子对，信噪比最高的离子对往往为定量提供了高灵敏度，而其他离子对则可提供辅助定性信息。在进行MRM监测时选择信噪比最高的离子对进行检测，以提高质谱确证的准确性。

图2 目标抗生素的色谱图Fig.2 Chromatograms of the target antibiotics

2.2 质谱分离

本方法中6 种氨基糖苷类抗生素的保留时间几乎相同，帕珠沙星和氟罗沙星的保留时间亦较为接近，但鉴于质谱检测器具有强大的质量鉴别能力，对于非同分异构的化合物，无需达到色谱分离，也可通过不同的质量通道进行质谱分离，从而实现目标化合物的专属测定。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准工作曲线与检出限

采用无检出抗生素的空白基质，按照1.4 节所述方法处理后加入目标抗生素混合标准溶液，配制成质量浓度范围为0.1 ～1 000 μg／L 的系列标准工作溶液，在优化的液相色谱和质谱条件下进行分析。10 种目标抗生素均以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x，mg／L）为横坐标做定量工作曲线，得到的线性回归方程的相关系数r2在0.995 6 ～0.999 8 之间，表明各目标抗生素在相应的浓度范围内呈良好的线性关系。

根据SPE-UPLC／MS／MS 的定量限（LOQ）公式［15］计算本方法定量限：

其中：IQL 为仪器的定量限（μg／L），即色谱峰信噪比等于10 时对应的目标物浓度（见表2）；R 为固相萃取回收率（%），是高、中、低3 个加标水平的回收率的平均值；C 为样品富集倍数。准确量取待测水样250 mL，过柱富集并浓缩后，用初始流动相定容至1 mL 进样分析，故C 为250。以色谱峰信噪比等于3 确定样品的检出限。本文方法的定量限为0.22 ～14.55 ng／L，检出限为0.07 ～4.37 ng／L（见表2）。

2.3.2 方法的回收率

采用在空白基质中添加标准溶液的方法进行添加回收率测定。分别添加氨基糖苷类抗生素低（0.02 μg／L）、中（1.0 μg／L）、高（40 μg／L）3 个水平，氟喹诺酮类抗生素和螺旋霉素低（0.002 μg／L）、中（0.10 μg／L）、高（4.0 μg／L）3 个水平，每个水平取3 份样品进行平行实验，按1.4 节方法处理后进行UPLC-MS／MS 测定，采用外标法定量。计算各待测化合物在空白基质中的加标回收率（见表3）。6 种AGs 的回收率差异较大，这是因为6 种AGs 虽然有着相似的化学结构，但其与阳离子交换剂作用的能力差别较大［16］。巴龙霉素、核糖霉素和依替米星的回收率较高（84.1% ～114.1%），可能是由于这3 种AGs 结构中含3 个或3 个以上的伯氨基，与阳离子交换剂的作用位点多；西索霉素、奈替米星和小诺霉素的结构中也含有多个伯氨基，但回收率却不及前3 种AGs，这可能是由于其pKb值较高，与阳离子交换剂作用力较弱，被保留在阳离子交换柱上的组分较少。氟罗沙星回收率低于其他两种FQNs，可能是因为氟罗沙星结构中含有多个吸电子基（F 原子），酸性较强，故减弱了与阳离子交换剂的亲和力。虽然后3 种AGs 和氟罗沙星的回收率偏低（50.4% ～70.6%），但是RSD 均较低（1.10%～9.64%），表明该方法比较稳定。

表2 10 种抗生素的线性方程、相关系数、仪器定量限、检出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，instrument quantitative limits （IQL），limits of detection and limits of quantification of the ten antibiotics

表3 水样中10 种抗生素的加标回收率及RSD（n＝3）Table 3 Recoveries and RSDs of the ten antibiotics in water samples （n＝3）

2.3.3 固相萃取柱的选择

固相萃取技术是目前测定抗生素最常用的前处理方法，可选择不同的固相萃取柱对水样中的多种目标化合物进行萃取和净化。本实验分别考察了弱阴离子交换柱（WAX）、混合型强阳离子（MCX）、亲水亲油平衡柱（HLB）及弱阳离子（WCX）固相萃取柱对目标抗生素的萃取回收效果（见图3）。结果表明：采用WAX 柱时，10 种目标抗生素的回收率几乎都为0，这是由于WAX 柱是弱阴离子交换柱，10 种目标抗生素在酸性（pH 3.0 ～4.0）条件下带正电荷，很难与阴离子交换剂进行离子交换，故被吸附在WAX 柱上的目标组分很少；采用MCX 交换柱时6种AGs 的回收率很低，经分析发现MCX 交换柱对AGs 等碱性化合物具有高度的选择性和灵敏度，故AGs 与MCX 交换柱结合较牢固，难以被洗脱；采用HLB 柱对3 种FQNs 抗生素的萃取回收率优于其他固相萃取柱，但是HLB 柱对6 种AGs 抗生素的回收效果差。故综合考虑后选用WCX 柱进行富集净化。比较了500 和150 mg 的WCX 柱，发现150 mg WCX 柱对10 种抗生素具有较好的回收率和选择性。

图3 固相萃取柱对10 种抗生素回收率的影响（n＝3）Fig.3 Effect of SPE columns on the recoveries of the ten antibiotics （n＝3）

2.3.4 洗脱液的优化

处理后的水样经过WCX 柱后，分别用2% （v／v）甲酸甲醇溶液、5% （v／v）甲酸甲醇溶液和10% 甲酸甲醇溶液洗脱，结果如图4 所示。之所以选择酸性洗脱剂，是因为WCX 柱的主要分离模式是阳离子交换作用，上样时，AGs 阳离子与WCX 柱中的H＋交换而使AGs 保留在柱上，用酸性洗脱剂洗脱，使其H＋与保留在柱上的AGs 阳离子进行交换从而将结合在离子交换剂上的AGs 洗脱下来。用2% （v／v）甲酸甲醇溶液洗脱时，10 种目标抗生素的回收率在19.0% ～79.0% 之间，随着甲酸体积分数增加至5% 时，10 种目标抗生素的回收率达到最大，为50.4% ～114.1%；继续增加甲酸体积分数至10% 时，10 种目标抗生素的洗脱回收率为41.7% ～109.2%。最终选择5% （v／v）甲酸甲醇溶液作为洗脱液。

图4 洗脱液对10 种抗生素回收率的影响（n＝3）Fig.4 Effect of eluents on the recoveries of the ten antibiotics （n＝3）

2.4 实际样品的测定

利用本文建立的测定方法分析了制药废水中抗生素的残留浓度。由表4 可知该制药废水中检出的抗生素主要为巴龙霉素、核糖霉素和螺旋霉素，这3种抗生素在出口水中的质量浓度范围为0.95 ～125.20 μg／L；巴龙霉素与核糖霉素最终去除率分别为95.77%、99.48%。巴龙霉素和核糖霉素在水相中的去除效果好主要是因为分子结构中都带有多个-NH2和-OH，这些基团可以与钙、镁等金属离子发生配位反应，或形成氢键，极易与固体介质颗粒发生吸附而从水相中去除。

由于螺旋霉素于采样前2 天就已停产，导致其在后续处理单元残留浓度高，原水中螺旋霉素的浓度远低于出口水的浓度。

由于物理和化学性质的区别，各废水处理环节对不同种类的抗生素的去除效果也会有所不同。化学处理-水解酸化池产生的大量发酵细菌和产乙酸菌，它们通过微生物降解作用对巴龙霉素有明显的去除作用，去除率达66.07%。好氧池的活性污泥含有丰富的好氧细菌，能对核糖霉素进行氧化分解，致使核糖霉素在该环节的去除率达99.06%。

表4 制药废水中10 种目标抗生素的测定（n＝3）Table 4 Determination of the ten antibiotics in the water samples from pharmaceutical manufacturer wastewater treatment plants （n＝3）

3 结论

建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱同时分析制药废水中10 种典型抗生素的方法，定量检测了这些抗生素在制药废水处理系统中的浓度分布。后续工作中还将补充这些抗生素在不同制药厂废水中的残留浓度数据，通过质量平衡分析掌握抗生素在不同制药废水处理系统中的消除机制，探究抗生素的主要去除方法，为今后的处理工艺改造、优化提供理论依据和技术支持。

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