石榴叶多酚对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

邢 佳，陆文娟，赵云霞，陶明煊

（南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097）

石榴叶多酚对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

邢 佳，陆文娟，赵云霞，陶明煊*

（南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097）

目的：探究石榴叶多酚对酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法：将60 只小鼠随机分为空白组，模型组，石榴叶多酚2低、中、高剂量组（100、200、400 mg/（kg·d））和阳性对照组（联苯双酯滴丸，150 mg/（kg·d）），每组10 只。空白组与模型组小鼠灌胃去离子水（0.1 mL/（10 g·d）），连续灌胃30 d；第31天，除空白组外，其余组小鼠均灌胃50%乙醇（12 mL/kg）建立急性肝损伤模型，12 h后，取小鼠眼球血清测定生化指标，取肝脏观察肝组织的超微结构。结果：模型组小鼠肝脏天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）活力及血清中甘油三酯（triglyceride，TG）水平、ALT和AST活力明显升高，亚显微观察显示小鼠肝细胞膜结构异常，线粒体畸形，内质网明显扩张，内质网膜上附着的核糖体脱落，肝细胞内出现较多脂滴；随着给药剂量的增加，石榴叶多酚2各剂量组对上述情况的改善作用也不断加强。结论：石榴叶多酚2对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。

石榴叶多酚；急性酒精性肝损伤；生化指标；超微结构

肝脏是酒精代谢的主要器官，酒精对肝细胞的直接作用将导致酒精性肝病[1-3]。酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）最初表现为脂肪肝，进而发展为酒精性肝炎、肝纤维化，最终导致肝硬化，甚至诱发肝细胞坏死及肝功能衰竭[3-5]。酒精在肝脏中的代谢过程为：乙醇在肝微粒体氧化酶系统中经乙醇脱氢酶转化为乙醛，而乙醛在P450酶系统中经乙醛脱氢酶转化为乙酸，最终生成水和二氧化碳[6-8]，但该代谢过程中的中间产物将直接危害肝脏的健康，导致肝脏乙醛中毒、酸中毒等[9]。据报道，在全球范围内，ALD的发病率呈逐年增高的趋势，酒精已成为仅次于肝炎病毒导致肝损伤的重要病因之一[10]。在临床医学上常采用美他多辛、联苯双酯滴丸、水飞蓟素类、多烯磷脂酰胆碱等药物治疗ALD[11]，但药物治疗对于晚期ALD并没有效果，且药物治疗对人体本身也有一定的伤害。因此，寻找天然高效的保肝产品已成为当今食品及医学领域共同的研究热点。

石榴（Punica granatum L.）叶中含有多种有效成分，赋予了石榴叶多种生理功能，如收敛止泻、软化血管、抗菌、抗病毒、美容、降低血脂水平、抗肿瘤、抗突变、抗氧化等[12-15]。在国外，石榴叶已作为一种理想的药食资源[16]，而在国内，石榴叶则多被废弃，造成资源的浪费。目前对石榴叶的研究多侧重于对其提取、纯化，以及探索其在抗氧化、消炎等方面的作用[17-19]，尚未见石榴叶多酚对ALD的预防及保健作用的报道。本研究拟采用石榴叶为原材料，探究石榴叶多酚对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用，以期为寻找预防和治疗ALD的有效方法提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

石榴叶（Punica granatum L. leaves）采于南京市鼓楼区，经洗净烘干后，用粉碎机粉碎，过60 目筛，避光保存备用。取粉末10 g，加入40%的乙醇溶液，调节pH值为2，置超声破碎器下进行破碎，60 ℃水浴1.5 h ，4 500 r/min离心10 min后过滤，滤渣再提取一次，合并上清液，旋转蒸馏得到浓缩液，冷冻干燥即得石榴叶粗多酚（crude polyphenols from Punica granatum L. leaves，CPPL），经AB-8树脂的分离纯化，冷冻干燥即得石榴叶多酚1（purified polyphenols from Punica granatum L. leaves 1，PPPL1），再过聚酰胺层析柱，冷冻干燥即得石榴叶多酚2（purified polyphenols from Punica granatum L. leaves 2，PPPL2）。

AB-8树脂、聚酰胺树脂 沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

1.1.2 动物

6 周龄雄性ICR小鼠，体质量（27±2） g，动物饲养许可证号：SYXK（苏）2012-0047。

1.1.3 试剂

酒精 南京创化化玻仪器有限公司；联苯双酯滴丸 浙江医药有限公司新昌制药厂；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、醋酸铀、柠檬酸铅南京建成生物工程研究所；戊二醛、无水乙醇和丙酮等南京荣世德有限公司；四氧化锇酸、中性树脂 美国Sigma公司。

1.1.4 仪器与设备

高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；JY92-Ⅱ超声波细胞破碎器 宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；722可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；H-7650日立透射电镜 日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性酒精性肝损伤模型建立

适应性喂养3 d后，将小鼠随机分为6 组：空白组，模型组，PPPL2低、中、高剂量组（100、200、400 mg/（kg·d）（以体质量计，下同）），阳性对照组（联苯双酯滴丸，150 mg/（kg·d）），每组10 只。空白组与模型组小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的去离子水；PPPL2各剂量组小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的PPPL2样品（PPPL2样品用去离子水配制）；阳性对照组小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的联苯双酯滴丸1次（药品用去离子水配制）。6 组小鼠连续灌胃30 d，期间供给全价颗粒饲料，不限制饲料及水。实验到31 d ，对各组小鼠禁食12 h但不禁水，之后除空白组外，其余组小鼠均灌胃50%酒精（12 mL/kg），建立急性酒精性肝损伤模型[20]。

1.2.2 样品制备

血清：取小鼠眼球血静置2 h后，3 500 r/min离心10 min，小心吸取血清。

肝匀浆：准确称取0.1 g肝组织，清洗、拭干、剁碎，加0.9 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），超声破碎，制成质量分数10%的肝匀浆。

肝组织切片（电镜观察样品）：将迅速选出的肝左叶中部切成1 mm3左右的块状，置于体积分数4%的戊二醛中固定。

1.2.3 AST、ALT、TG水平测定

严格按照试剂盒说明书方法操作，测定AST、ALT、TG水平。

1.2.4 肝组织超微结构观察

样品先用PBS清洗，再置于四氧化锇酸中固定2 h，用0.1 mol/L PBS清洗，丙酮梯度脱水，丙酮及树脂混合液浸透1 h，纯树脂浸透2 h。随后，对样品进行包埋，在聚合炉中聚合24 h，修块、定位，用钻石刀切成超薄切片附到铜网后，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，沥干，用透射电子显微镜进行观察和拍照[21]。

1.3 数据统计分析

实验数据采用DPS 13.5软件进行统计学分析，数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 PPPL2对酒精所致急性肝损伤小鼠肝脏中AST、ALT活力的影响

表1 PPPL2对小鼠肝脏中AST、ALT活力的影响（x±s，n＝10）Table 1 Effect of PPPL2 on AST and ALT levels in liver of mice (x±s,n= 10)

由表1可知，模型组小鼠肝脏中AST、ALT活力显著高于空白组（P＜0.05或P＜0.01），提示小鼠急性酒精性肝损伤模型建立成功。与模型组相比，PPPL2各剂量组小鼠肝脏中AST、ALT活力随着PPPL2剂量的增加逐渐降低，其中PPPL2高剂量组小鼠肝脏中ALT活力已达到阳性对照组水平，较模型组降低了10.62%；PPPL2高剂量组小鼠肝脏中AST活力较模型组降低了22.88%。以上结果提示PPPL2可有效降低小鼠急性酒精性肝损伤肝组织中AST、ALT活力，表明PPPL2对小鼠急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。

2.2 PPPL2对酒精所致急性肝损伤小鼠血清TG含量和AST、ALT活力的影响

表2 PPPL2对小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力的影响（x±s，n＝10）Table 2 Effect of PPPL2 on TG, AST and ALT levels in serum of mice (x±s,n= 10)

由表2可知，模型组小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力较空白组分别增长了46.67%、145.26%、23.2%，其中TG含量和AST活力与空白组的差异达到了极显著水平（P＜0.01）。与模型组相比，PPPL2各剂量组小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力随着PPPL2剂量的增加逐渐降低，PPPL2高剂量组小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力分别较模型组降低了22.7%、34.57%、14.65%，其中PPPL2高剂量组小鼠血清中TG含量和ALT活力已达到阳性对照组水平，而AST活力甚至比阳性对照组更低。以上结果提示PPPL2可有效降低急性酒精性肝损伤引起的小鼠血清中TG含量和AST、ALT活力的升高，表明PPPL2对小鼠急性酒精性肝损伤具有较好的保护作用。

2.3 小鼠肝组织超微结构分析

透射电镜下观察石榴叶多酚2对小鼠急性酒精性肝损伤的肝组织超微结构的影响，结果如图1所示。

图1 各组小鼠肝组织的超微结构Fig.1 Ultrastructure of mouse liver tissue in each group

如图1A所示，空白组小鼠肝组织的细胞核大且圆，核膜清晰无损坏，核内清晰可见核仁，线粒体形状规则且丰富，线粒体嵴清晰，粗面内质网整齐排列，可见丰富的核糖体颗粒在其上分布，染色质平均分布在核内，细胞质丰富，无核糖体脱落及脂质化现象。

如图1B所示，模型组小鼠肝细胞损伤明显，细胞内可见较多脂滴，整体细胞质结构杂乱，染色质分布异常，核膜皱缩，线粒体呈杆状，线粒体双侧膜及嵴模糊，粗面内质网杂乱并有扩张肿胀现象，核糖体颗粒减少并脱落。

如图1C所示，PPPL2低剂量组小鼠肝细胞内存在较多的脂滴但较模型组少，核膜呈不规则锯齿状，线粒体形状较模型组规则，线粒体膜及嵴均不清晰，内质网明显肿胀，排列散乱，核糖体脱落明显，整体较模型组有减轻的趋势。

如图1D所示，PPPL2中剂量组小鼠肝细胞内明显可见脂滴，细胞核形状不规则，局部明显内陷或者凸出，线粒体较模型组增多，大多呈圆形或椭圆状，线粒体周围粗面内质网明显扩张，并有明显的核糖体脱落现象。

如图1E所示，PPPL2高剂量组小鼠肝细胞内偶见少许脂滴，核膜完整呈圆形，细胞质分布均匀，线粒体数量较模型组更多且形状更规则，线粒体嵴及双层膜清晰可见，正体接近空白组，在视野内未见内质网肿胀现象。

如图1F所示，阳性对照组小鼠肝组织的细胞核呈不规则形态，但核膜完整，线粒体丰富度与空白组相差不多，线粒体嵴清晰，外膜呈圆形或椭圆形，无不规则线粒体，染色质分布均匀，细胞质粗面内质网扩张，视野内未见脂滴。

3 讨 论

ALD包括一系列肝脏的损伤，从单纯性脂肪肝可发展为肝硬化和肝细胞癌。酒精已被认为是导致ALD的主要因素[22]，酒精代谢将导致肝细胞的氧化还原处于失衡状态、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）出现异常比率、内质网处于氧化应激状态及线粒体功能发生障碍等一系列非正常生理状态[23-24]。

肝脏是含有线粒体最丰富的器官之一，每个肝细胞中约有800 个线粒体，其具有重要的生理功能，如：为细胞提供能量，参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程[25]，但当机体摄入大量的酒精，乙醇在肝脏中的代谢会直接破坏线粒体的结构，从而导致线粒体功能的变化甚至丧失，并使存在于细胞浆和线粒体中的AST及ALT释放入血液，引起血清中ALT和AST活力的升高[26]。肝细胞中还普遍存在内质网，内质网具有合成并转运蛋白质、脂类的功能，同时还具有有效清除脂溶性代谢废物及有害物质等功能，而内质网应激是指细胞内蛋白质加工运输发生障碍及生理功能发生紊乱的一系列病理过程，研究显示，内质网应激也参与了肝损伤的过程，内质网功能一旦发生紊乱，脂蛋白的合成将会受到抑制，而TG的合成功能正常时，导致脂肪不能顺利运输出细胞，脂肪在肝细胞中逐渐堆积，最终出现脂滴[27]。另外，乙醇的中间代谢产物会破坏三羧酸循环的正常运转，使得脂肪酸的氧化受到阻碍，磷酸二羟丙酮转变为α-磷酸甘油，而α-磷酸甘油与脂肪酸作用后合成的TG沉积在肝细胞内，也将导致肝细胞中出现脂滴[28]。

临床上通过测定ALT、AST活力和TG水平作为判断肝细胞损伤的重要指标之一[29]，因此通过研究TG含量和ALT、AST活力，可以推断出小鼠肝脏的健康状况。本实验造模后发现，小鼠肝脏AST、ALT活力及血清中TG含量和ALT、AST活力均有明显升高，提示小鼠急性肝损伤模型建立成功。实验结果表明，PPPL2对酒精所致的小鼠肝脏AST、ALT活力的升高及血清中TG含量和ALT、AST活力的升高均有所改善，尤其是PPPL2高剂量组的改善作用更加明显。表明PPPL2可改善因酒精引起的TG含量和ALT AST活力升高现象，说明PPPL2可有效提高肝脏的酒精代谢能力，阻止脂肪在肝细胞中的沉积，对ALD有一定的治疗作用。

本实验通过观察小鼠肝组织的超微结构发现：造模成功后，小鼠肝细胞中线粒体变形，呈不规则的畸形状态，肝细胞内出现较多脂滴，其内质网扩张、核糖体颗粒脱落等现象明显；而随着PPPL2剂量的增加，PPPL2各剂量组小鼠肝细胞的线粒体逐渐呈现规则状，其中PPPL2高剂量组小鼠肝细胞的线粒体形态与空白组无明显差异，脂滴也随着PPPL2剂量的增加而减少，内质网的病症则相应得到改善，这些结果提示PPPL2对小鼠急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。该保护作用机理可能与石榴叶多酚的抗氧化活性有关，PPPL2的抗氧化作用可能是通过提高清除自由基的酶的活性，抑制自由基介导的脂质过氧化反应来实现的，从而减轻酒精对小鼠肝脏的损伤。

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Protective Effect of Polyphenols from Punica granatum L. Leaves against Alcohol-Induced Acute Hepatic Injury in Mice

XING Jia, LU Wenjuan, ZHAO Yunxia, TAO Mingxuan*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Objective: To investigate the protective effect of purified polyphenols from Punica granatum L. leaves 2 (PPPL2) on acute alcoholic hepatic injury in mice. Methods: Totally 60 mice were randomly divided into control group, model group, low-, middle- and high-dose PPPL2 groups, and positive control group (bifendate, 150 mg/(kg·d)) of 10 mice each. The mice from the control and model groups were administrated with deionized water (0.1 mL/(10 g·d)) daily by gavage for 30 consecutive days. The mice from three different dose groups were administrated with PPPL2 at 100, 200 and 400 mg/(kg·d)), respectively. The mice from the positive control group were administrated with bifendate (150 mg/(kg·d)). The model of acute alcoholic liver injury was established on the 31stday, and all mice were gavaged with 50% alcohol (12 mL/kg), except for the control group. Biochemical indicators of ocular blood in mice were observed. Results: Compared with the model group, the levels of glutamic-oxaloacetic transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), and triglyceride (TG) were obviously decreased in the treatment groups, and the mice from these treatment groups had reduced expansion of mitochondria and glycogen deposition. In addition, the endoplasmic reticulum was not obviously outspread and lipid droplets were reduced in hepatic cells. Conclusion: Polyphenols from pomegranate leaves have protective effect on alcoholic hepatic injury.

polyphenols from pomegranate leaves; acute alcoholic hepatic injury; biochemical indicators; ultrastructure

TS201.3

A

1002-6630（2015）21-0253-05

10.7506/spkx1002-6630-201521047

2014-12-23

江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（KYLX_0729）

邢佳（1989—），女，硕士研究生，研究方向为生物活性物质与保健功能因子。E-mail：Christina_320@yeah.net

*通信作者：陶明煊（1970—），男，副教授，硕士，研究方向为生物活性物质与保健功能因子。E-mail：45017@njnu.edu.cn