小胶质细胞介导的兴奋性氨基酸在大鼠DAI神经损伤中的作用

·论著·

小胶质细胞介导的兴奋性氨基酸在大鼠DAI神经损伤中的作用

李苑1，2，易善勇1，王松军1，刘霞1，齐倩1，丛斌1*

(1.河北医科大学基础医学院法医学系，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学教务处实验诊断教研室，河北 石家庄 050017)

[摘要]目的观察大鼠弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)模型中小胶质细胞介导的兴奋性氨基酸在神经损伤中的作用。方法75只SD大鼠随机分为假手术组、损伤组、米诺环素干预组各25只，通过免疫组织化学方法观察DAI后6、12、24、48和72 h CD11b分布特点，并通过高效液相色谱对脑组织中的兴奋性氨基酸进行定量分析。结果打击后12 h小胶质细胞数量明显增加，损伤组大脑皮层CD11b的表达在打击后12 h达到高峰，脑干CD11b的表达在打击后24 h达到高峰。给予米诺环素干预后CD11b的表达在12～72 h明显减少。打击后脑组织即有谷氨酸和天门冬氨酸含量升高，损伤组大脑皮层谷氨酸及天门冬氨酸12 h到达高峰，脑干组织谷氨酸和天门冬氨酸损伤后24 h达到高峰，之后逐渐下降，而米诺环素干预组12～72 h均低于损伤组。结论米诺环素可以通过抑制小胶质细胞的激活作用降低脑组织中谷氨酸及天门冬氨酸的含量。

[关键词]弥漫性轴索损伤；氨基酸类；米诺环素doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.08.001

[收稿日期]2015-06-14；[修回日期]2015-07-17

[基金项目]国家自然科学基金(C2008001038)；河北省自然科学基金(H2013206138)

[作者简介]李苑(1986-)，女，河北石家庄人，河北医科大学教务处助教，医学硕士，从事法医病理学研究。

通讯作者*。E-mail：cong6406@126.com

[中图分类号]R651.1[文献标志码]A

Effect of microgila-induced excitatory amino acids on nerve injury in DAI rat

LI Yuan1，2,YI Shan-yong1,WANG Song-jun1,LIU Xia1,QI Qian1,CONG Bin1*

(1.Institute of Forensic Medicine,the Basic Medical School of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;

2.Institute of Laboratory Diagnostics,Academic Affairs,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)

Abstract[] ObjectiveTo explore the role of microglia-induced excitatory amino acids(EAA)- excitotoxicity in the diffuse axonal injury(DAI) rat.MethodsSeventy-five SD rats were randomly divided into Sham group,injury group and minocycline treated group,25 rats a group.Immunohistochemical technique was used to examine the expression of CD11b after DAI 6,12,24,48 and 72 h.High performance liquid chromatography was used to detect the content of glutamate and aspartate.ResultsAfter injury,the microglia obviously increased,and CD11b expression in the cortex of injury group reached the peak.CD11b expression in the brain stem peaked at 24 h after injury.After minocycline treatment,CD11b expression significantly reduced at 12-72 h.Meanwhile，glutamate and aspartate level significantly increased after injury,reached peak in the cortex at 12 h in cortex,and in the brain stem at 24 h.Later,glutamate and aspartate decreased.The glutamate and aspartate of minocycline treated group were significantly lower than those of injury group at 12-72 h after injury.ConclusionMinocycline can restrain microglia activation and decrease the expression of glutamate and aspartate in the brain to develop the therapevtice effect.

[Key words]diffuse axonal injury;amino acids;minocycline

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)是指头部遭受钝性特殊外力，产生加速运动时，在剪应力的作用下，脑内发生的以神经轴索肿胀、断裂为特征的一系列的病理生理变化，已有研究发现在DAI大鼠脑组织中可见大量小胶质细胞激活，其过度激活会导致DAI后神经元“二次损伤”[1]。小胶质细胞在中枢神经系统中不仅起支持和营养作用，同时作为中枢神经系统内兴奋性氨基酸代谢的重要场所，激活的小胶质细胞可释放大量的兴奋性氨基酸，而兴奋性氨基酸过多产生的兴奋毒性作用可以导致神经损伤[2]，目前关于小胶质细胞激活在兴奋性氨基酸兴奋毒性中的作用还不明确。本研究在DAI后采用小胶质细胞抑制剂米诺环素干预，初步探讨DAI后小胶质细胞介导的兴奋性氨基酸在脑损伤中的作用。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康雄性SD大鼠75只，体质量(280±18) g，由河北省实验动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、损伤组和米诺环素干预组各25只，各组根据处死时间分为打击后6、12、24、48和72 h共5个亚组进行观察，每亚组5只。

1.2模型的制作各组大鼠于手术前12 h禁食，自由饮水。参照 Marmarou[3]的方法制作大鼠DAI模型。假手术组给予手术及打击前处理，不给予打击；米诺环素干预组在打击后腹腔注射45 mg/kg米诺环素，之后1次/d，共3 d；损伤组在相同时段腹腔注射等量的生理盐水。米诺环素的剂量选择参考Hewlett等[4]的米诺环素神经保护作用机制研究。

1.3CD11b免疫组织化学染色大鼠开颅取脑后去除硬脑膜，沿正中线矢状切开，固定12 h后常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋成块。矢状面进行连续切片，展片后用挂有多聚赖氨酸的载玻片捞取，切片烤干后4 ℃保存备用。结果判定：CD11b阳性表达位于小胶质细胞胞膜上，阳性反应呈棕黄色。并进行半定量分析，计算积分光密度(optical density,OD)值。

1.4高效液相色谱法检测脑组织中谷氨酸(glutamic acid,Glu)和天门冬氨酸(aspartic acid,Asp)含量将各组大鼠直接快速断头取脑，取大脑皮层及脑干组织称质量，按0.1 kg/L加入无水乙醇，电动匀浆机磨成匀浆,吸出匀浆液,在18 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,取上清液25 mL加入125 mL无水乙醇在-70 ℃冰箱冻存备用。

应用HP1090高效液相色谱仪设定柱温40 ℃，流速0.45 mL/min，荧光检测器设定激发波长为Ex340 nm，发射波长为Em450 nm。取样品中的某成分峰的保留时间与标准品中相应峰的保留时间相一致者作为Glu、Asp峰。绘制标准曲线后对脑组织中的Glu、Asp浓度进行定量，并检测该方法的精密度和回收率。

2结果

2.1CD11b免疫组织化学结果观察损伤组打击后12 h小胶质细胞数量明显增加，呈棕褐色，突起变粗、变短，胞体增大、变圆，主要分布于损伤轴索及小血管的周围；大脑皮层CD11b的表达在打击后12 h达到高峰，脑干CD11b的表达在打击后24 h达到高峰，之后逐渐减少。与损伤组比较，米诺环素干预组小胶质细胞数量明显下降，细胞变小。

假手术组在6～72 h内小胶质细胞激活程度虽有波动，但基本上比较平稳；损伤组在受打击后6～72 h小胶质细胞激活程度均明显高于假手术组(P<0.05)，且在12 h达高峰，以后逐渐降低；米诺环素干预组在受打击后6 h与损伤组差异无统计学意义，仍在12 h达高峰，但与损伤组已明显降低(P<0.05)，且在24、48和72 h均明显低于损伤组(P<0.05)。见表1，2，图1，2。

2.2Glu及Asp的测定

2.2.1标准曲线的制作本研究应用高效液相色谱法对大脑皮质和脑干组织的Glu和Asp的含量进行测定。Glu保留时间为5.584 min，定量线性方程为y=77.615 84x+7.534 52。Asp保留时间为3.740 min，定量线性方程为y=94.472 84x+1.056 43。精密度试验结果：Glu和Asp迁移时间相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.79%、1.1%;峰面积的RSD分别为5.1%、4.7%。回收率试验结果：Glu的回收率为97.5%(RSD=2.1%，n=5)；Asp的回收率为94.1%(RSD=3.5%，n=5)。见表3。

2.2.2各组大脑皮层部位Glu、Asp测定结果假手术组大脑皮层和脑干Glu浓度在6～72 h内虽有波动，但基本上较平稳；损伤组在6～72 h内，大脑皮层和脑干中Glu浓度较假手术组均有明显升高(P<0.05)，Glu在大脑皮层12 h、在脑干24 h达高峰，以后逐渐下降；米诺环素干预组在大脑皮层和脑干6 h与损伤组差异无统计学意义(P>0.05)，但在12、24、48和72 h较损伤组均明显降低(P<0.05)。

假手术组大脑皮层和脑干中Asp浓度在6～72 h内虽有波动，也基本较平稳；损伤组在6～72 h内，大脑皮层和脑干Asp浓度较假手术组明显升高(P<0.05)，Asp在大脑皮层12 h、脑干24 h达高峰，以后逐渐下降；米诺环素干预组在大脑皮层和脑干6 h与损伤组差异无统计学意义(P>0.05)，但在12、24、48和72 h较损伤组明显降低(P<0.05)。见表4。

表1　3组大脑皮层部位小胶质细胞表达比较

* P<0.05与假手术组比较　# P<0.05与损伤组比较( q检验)

* P<0.05与假手术组比较　# P<0.05与损伤组比较( q检验)

表43组不同时点大脑皮层和脑干Glu、Asp变化

Table 4Level of Glu,Asp in crotex and brain stem in three groups

组别大脑皮层Glu的浓度6h12p4p8h72h假手术组 15.73±1.5314.78±1.1113.89±1.0316.47±1.3115.86±0.93损伤组 31.49±4.89*37.21±3.41*30.18±3.62*24.83±2.48*21.43±2.14*米诺环素干预组27.86±3.63*28.99±4.01*#25.11±2.04*#20.34±3.31*#18.11±1.73#F 25.9130.6674156.87813.950413.959P 0.0000.0000.0000.0010.001组别脑干Glu的浓度6h12p4p8h72h假手术组 9.34±1.149.46±1.279.45±1.349.75±1.539.51±1.24损伤组 22.04±2.45*29.75±2.63*31.97±3.16*26.09±2.97*14.65±2.64*米诺环素干预组20.76±3.39*22.52±3.38*21.41±3.49*#19.00±2.29*#11.42±1.93#F 39.02179.52079.52761.4368.270P 0.0000.0000.0000.0000.006组别大脑皮层Asp的浓度6h12p4p8h72h假手术组 2.14±0.252.62±0.292.16±0.152.46±0.262.44±0.31损伤组 8.77±1.39*10.78±1.43*8.68±1.17*6.77±1.034*5.83±1.23*米诺环素干预组7.70±1.30*8.52±0.93*#6.65±0.91*#4.92±0.88*#3.52±0.98#F 63.61888.59375.40636.49617.488P 0.0000.0000.0000.0000.000

表4　(续)

*P<0.05与假手术组比较#P<0.05与损伤组比较(q检验)

3讨论

DAI可激活对环境敏感的小胶质细胞，小胶质细胞在中枢神经系统中不仅起支持和营养作用，还是中枢神经系统内兴奋性氨基酸(excitatory amino acids,EAA)代谢的重要场所，激活后成“阿米巴”样，分泌大量的细胞因子、炎症趋化因子、类花生酸类、蛋白水解酶及补体，还可释放大量的兴奋性氨基酸。且损伤的轴索可释放Aβ，通过Glu受体促进小胶质细胞分泌Glu。本研究模型利用Marmarou等的直线加速损伤原理，造成DAI模型大鼠，应用米诺环素抑制小胶质细胞的激活；米诺环素是一种半合成的亲脂性四环素类衍生物[5]，可通过血-脑屏障。近年来的研究表明，米诺环素是一种有效且安全的神经保护剂[6-8]。Nikodemova 等[9]研究发现米诺环素具有抑制小胶质细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的增殖和活化的效应。目前尚没有特异性调节小胶质细胞的有效药物，因此米诺环素这种最为广泛而又有效的小胶质细胞活性抑制剂[10]可阐明小胶质细胞在神经系统中的功能。

本研究结果显示，米诺环素干预组与损伤组比较，在12、24、48和72 h时CD11b表达差异有统计学意义，24 h以后小胶质细胞激活幅度明显减少，证实米诺环素可明显抑制小胶质细胞的激活；同时与损伤组比较，米诺环素干预组大脑皮层在12 h后、脑干在24 h后Glu及Asp升高幅度明显降低，含量均明显低于损伤组，与小胶质细胞降低幅度一致，证实米诺环素可通过抑制小胶质细胞的激活作用降低脑组织中Glu及Asp的含量。

EAA包括Glu和Asp。Glu是中枢神经系统中含量最丰富的EAA，参与多种物质的代谢调节。中枢神经系统急性损伤后Glu的大量释放是造成一系列级联反应进而导致细胞死亡的主要原因[11]，这需要通过与其特异性受体的结合得以实现[12],目前对于Glu受体功能的认识仍不完全。Glu受体家族的成员较多，这些受体广泛在各种神经元及胶质细胞中表达，既可以介导兴奋性效应，也可以介导抑制性效应，并参与其他离子型受体的调节[13]。神经元去极化时，Glu以Ca2+依赖方式释放到突触间隙中，激活位于突触后的Glu受体使其过度激活介导大量的Ca2+内流，Ca2+内流在N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA受体)介导的神经系统损伤中起了重要作用[14]。对于兴奋性氨基酸介导的细胞死亡通路及其相互作用和NMDA受体激活后下游靶点研究的突破，可进一步明确DAI中小胶质细胞介导的兴奋毒性在二次损伤中的作用。(本文图见封二)

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(本文编辑：刘斯静)