猪伪狂犬病与猪圆环病毒病混合感染的PCR诊断

卢 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，梅书棋

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064）

猪伪狂犬病与猪圆环病毒病混合感染的PCR诊断

卢 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，梅书棋*

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064）

为了解猪场20日龄内的仔猪发病死亡的病因，对2头病猪的肺脏、淋巴结、脑等组织进行病原学诊断。对2头病猪的组织样进行PCV2-ORF2基因、PRV-gE基因的PCR扩增。结果表明样品均能扩增出PCV2-ORF2基因、PRV-gE基因的特异性条带，这与预期的片段大小相符，说明这2头仔猪的病因为猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂病病毒野毒（PRV-gE）混合感染。这为猪场疾病的诊断和治疗提供实践与理论依据，对分析猪场接种疫苗产生免疫抗体的效果进行评估，从而不断地制定并完善免疫程序。

猪；PCV2，PRV-gE；PCR

猪圆环病毒病与猪瘟、蓝耳病并称为中国养猪业“三座大山”。猪圆环病毒有2个血清型，即1型(PCV1)和2型(PCV2)。其中猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)引发仔猪断奶多系统衰弱综合征和猪的皮炎与肾病综合征等疾病，主要侵害机体的免疫系统，可以造成机体的免疫抑制[1]。PCV2及其相关的猪病已在全世界范围内发生和流行，发病率可高达60%，死亡率达10%～30%。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起多种家畜和野生动物共患的以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要特征的一种急性传染病。PRV可以感染各个年龄阶段的猪，母猪临床表现为流产、产死胎、木乃伊胎[2]；仔猪临床表现为神经系统症状、消瘦、死亡，15日龄内的仔猪病死率可达100%；但对于育肥猪的临床症状不明显，仅仅表现为生长抑制及呼吸系统疾病[3]。至今为止发现PRV基因组上共有70种不同的基因[4]。其中gE基因是PRV最重要的毒力基因，与PRV对于宿主的致病力密切相关；gB基因主要参与病毒的复制。

本研究建立了针对PCV2-ORF2基因和PRV-gE基因的PCR鉴定，为进一步开展PRV、PCV的防控提供了重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料病料来源于湖北某猪场20日龄左右病猪的肺脏、脑、淋巴结等组织。

1.1.2 主要试剂DNA DL2000 Marker、DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶、Taq DNA聚合酶均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物合成圆环病毒ORF2基因引物序列：F：5'-AATC CGCTATTTACCCAGTGG-3'，R：5' -GCTGTAAACCTCGCCACT-3'，预期扩增片段大小为494 bp。

伪狂犬病毒gE基因引物序列：F：5'-GACGAGCCCCGCTTCCAC GCGA-3'，R：5'-CACCGGTCGC GAGCAGCGGCT-3'，预期扩增片段大小为366 bp。

最后，PCV2ORF2基因和PRVgE基因引物由上海生工合成。

1.2.2 DNA的提取按照DNA提取说明书进行提取。

1.2.3 PCR检测条件以提取的基因组DNA为模板进行PCR反应，PCR反应条件95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环后，72 ℃后延伸5 min。

2 结果

2.1 PCV2型ORF2基因的PCR扩增结果

以所提取的DNA为模板，进行PCV2ORF2基因的PCR扩增。取5 μL PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，得到了预期的494 bp的DNA条带，结果见图1。

2.2 PRV gE基因的PCR扩增结果

以所提取的DNA为模板，进行PRV gE基因的PCR扩增。取5 μL PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，得到了预期的366 bp的DNA条带，结果见图2。

2.3 PCR扩增结果

图1 PCV2-ORF2基因的PCR扩增结果

图2 PRV g'E基因的PCR扩增结果

通过PCR检测结果可知，病猪已感染了猪伪狂犬病病毒野毒和圆环病毒。结果见表1。

3 讨论

PCV2感染后导致猪的机体免疫力或应答能力下降，使其疫苗免疫效果降低或丧失；产生的免疫抑制易引发其他病原的混合感染或继发感染，导致猪的生产性能下降甚至死亡[5]。在湖北、广东、北京、天津、吉林、山东、湖南、河南等地区的大型猪场发现有母猪流产、死胎及木乃伊胎等疑似PRV的现象，也伴有初生仔猪大批死亡的病例[6-7]，当前大多数猪场采用gE缺失疫苗进行免疫，但是由于PRV野毒潜伏期较长，在育肥猪体内不表现出临床症状，随时排毒给妊娠母猪或仔猪，这就导致了免疫程序的复杂性及不确定性；况且PRV疫苗为抗感染免疫疫苗，对感染PRV的猪免疫后可减轻其临床症状、缓解病情，尽可能的挽回经济损失，却不能彻底杀灭病毒，也不能清除潜在感染。所以，对于猪场有必要定期地对整个猪群进行监测，以更好地制定免疫计划。

表1 PCR扩增结果表

[1] Segalés J，Rosell C，Domingo M，et al.Pathological findings associated with naturally acquired porcine circo virus type2 associated disease[J].Vet Microbiol，2004，98：137-149.

[2] Perez L，Perera C，Frias M，et al.A multiple SYBR Green I-based realtime PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2，porcine parvovirus，pseudorabies virus and Torque tenosus virus 1 and 2 in pigs[J].Journal of Virological Methods，2012，179(1)： 233-241.

[3] Yang X， Forier K， Steukers L，et al.Immobilization of pseudorabies virus in porcine tracheal respiratoiy mucus revealed by single particle tracking[J].PloS One，2012，7(12)：51-54.

[4] Ferrari M，Brack M，Romanelli T，et al.A study of the ability of a TK-negative and gl/gEnegative pseudorabies virus (PRV) mutant inoculated by different routes to protect pigs against PRV infection[J]. Journal of Veterinary Medicine，2000，47(10)：753-762.

[5] 罗黛青.猪圆环病毒病的诊断与防控对策[J].畜禽业，2015， 309 (1)：12-13.

[6] 彭金美，安同庆，赵鸿远，等.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J].中国预防兽医学报，2013，35(1)： 1-4.

[7] 隋慧，杨金生.猪伪狂犬病毒LX株的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医，2013，40(6)：226-229.

2015-04-04）

国家科技支撑计划项目(2011BAD28B01)、国家生猪产业技术体系项目(CARS-36)、湖北省农业科技创新中心创新团队项目(2011-620-001-003)、湖北省高端人才引领培养计划、湖北省公益性科技研究(2013BBB15)

卢琴（1989-），女，湖南常德人，研究实习员，硕士研究生，主要从事兽医病理学与食品安全评价。通讯作者：梅书棋。