应用响应面法优化香菇菌糠多糖提取工艺*

赵春艳，熊 勇，高观世，吴素蕊**

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南民族大学民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南 昆明 650500）

〈贮运加工〉

应用响应面法优化香菇菌糠多糖提取工艺*

赵春艳1，熊 勇2，高观世1，吴素蕊1**

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南民族大学民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南 昆明 650500）

为优化香菇（Lentinus edodes）菌糠多糖的提取工艺，首先采用单因素试验，再根据中心组合试验Box-Behnken的设计原理，采用三因素三水平的响应面法分析确定香菇菌糠多糖提取各工艺条件的影响因素。香菇菌糠多糖提取的最佳工艺条件为提取温度84℃、提取时间6 h、水料比55:1（mL·g-1），多糖最大提取率5.61%。响应面优化法提供的参数准确可靠，按该工艺能够提高香菇菌糠的多糖提取率。

香菇；菌糠；多糖；响应面分析法

香菇 [Lentinus edodes(Berk.)Sing.]是伞菌纲（Agaricomycetes） 伞菌目 （Agaricales)光茸菌科（Omphalotaceae） 香菇属（Lentinus） 的食药兼用大型真菌[1]，是广泛栽培品种。香菇多糖（lentinan，LNT）具有明显的抗HIV、抗肿瘤、抗感染、改善免疫系统功能、调节血糖血脂、降低血压等作用，因而深受人们喜爱[2-8]。大型真菌多糖作为免疫促进剂药物倍受关注，而香菇多糖是研究比较深入的多糖之一[9]。目前，在香菇子实体多糖方面研究较为全面，但对香菇菌糠多糖研究甚少。香菇菌糠是香菇采收后，其废弃的培养料（即菌糠），其中残留大量香菇菌丝体，富含蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素及多糖等生物活性物质，与子实体具有相似的生物活性和功能[10]。香菇作为大量栽培的食用菌，其菌糠量非常大，利用其菌糠提取多糖，不仅可在产业循环经济中提高附加值，延伸产业链，还可以消耗大量菌糠，减少污染，实现经济和生态效益的双赢[11]。

本研究对香菇菌糠多糖提取工艺中提取温度、时间、水料比等影响因子进行综合分析，最终获得香菇菌糠中多糖提取工艺的最佳条件，为香菇菌糠中多糖的提取、制备和应用研究提供科学的参考依据。

1　试验材料与方法

1.1试验材料与试剂

香菇子实体采后的香菇菌糠，来源于中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所。

葡萄糖、蒽酮、浓硫酸等试剂皆为分析纯。

1.2主要仪器

电子粉碎机、DU7400紫外分光光度计、恒温水浴锅、电子天平、高速台式离心机。

1.3原料预处理

干燥的香菇菌糠粉碎，以备用。

1.4香菇菌糠多糖提取工艺流程

香菇菌糠烘干→粉碎→过筛 (70目)→称重（0.1000 g）→浸提（在不同时间、温度、水料比的条件下提取） →离心（12 000 r·min-1） →取上清液→定容至30 mL→再移取上清液（500 μL） →蒽酮-硫酸试剂（5 mL）→摇匀水浴→冷却→测吸光度。

1.5标准曲线制作

利用蒽酮法[12]的反应原理，制作标准曲线，测定香菇菌糠多糖于波长620 nm处的吸光度，将测试结果以多糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线并求出回归方程。

1.6菌糠多糖提取正交试验设计

翻开课本或笔记，学生找到了正切函数的定义，设角α的终边和单位圆交于点(x，y)，当x≠0时，当x=0时(α终边在y轴上，90° 是其中的一个角)，tan α没意义．

以温度、时间、水料比这三个单因素试验为基础，根据Box-Behnken中心组合试验的设计原理，应用三因素三水平响应面（response surface methodology，RSM）的分析方法[13-14]，确定影响工艺条件的因子，以多糖提取率作为响应值绘制响应面与等高线图，分析和优化最佳的提取条件。

1.7菌糠多糖提取方案和因素水平

采用Design Expert8.0软件及中心组合试验Box-Behnken设计方案，选取单因素（提取温度、提取时间、水料比），对试验最佳结果进行综合分析，试验以提取温度、提取时间、水料比为影响因素，以-1、0、1表示各因素的各水平值，采用响应面分析方法作三因素三水平试验分析，见表1。

表1　响应面分析试验因素及水平Tab.1　Factors and levels of response surface analysis in this test

2　结果与分析

2.1标准曲线绘制

通过处理的葡萄糖标样，以蒸馏水为空白对照,利用紫外分光光度度计在620 nm处测定溶液的吸光度，重复3次求平均值，结果见图1。

图1 葡糖糖标准曲线Fig.1　Standard cure of glucose content determination

2.2单因素试验结果

2.2.1提取温度对香菇菌糠多糖提取率的影响

称取0.1000 g的6份香菇菌糠，放置于10 mL试管中，分别加3 mL蒸馏水，摇匀水浴加热，设置温度梯度为50℃～100℃，以10℃为间隔，取6个值，提取4 h，冷却后10 000 r·min-1离心10 min取上清液，30 mL去离子水定容，分别取0.5 mL溶液，再用蒸馏水稀释1倍，摇匀后水浴（90℃）15 min，冷却至常温，测吸光度，取3次平均值，再根据标准曲线求含多糖量，试验结果见图2。

2.2.2提取时间对香菇菌糠多糖提取率的影响

准确称取6份0.1000 g，各加入3 mL蒸馏水，于60℃下分别提取2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，离心定容后测定其多糖的提取率（方法同2.2.1），结果见图3。

图2　提取温度对香菇菌糠多糖提取率的影响Fig.2　Effect of temperature on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

图3　提取时间对香菇菌糠多糖提取率的影响Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

由图3可知，随着时间的增加，香菇菌糠多糖的提取率随之增高；当时间到6 h时多糖菌糠提取率达最大值；随后提取率开始呈下降趋势。因此，6 h左右为最佳提取时间。

2.2.3水料比对香菇菌糠多糖提取率的影响

称取0.1000 g的6份香菇菌糠，放置于10 mL试管中，分别加3 mL蒸馏水，摇匀水浴加热，设置水料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g） 6个等距梯度，分别按照顺序加入分别加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL蒸馏水，60℃水浴加热4 h后，离心定容后测定多糖的提取率（方法同2.2.1），结果如图4所示。

由图4表明，在试验设定条件下，水料比增加，多糖提取率呈增加趋势，水料比达60:1时多糖提取率最大。因此，水料比选择60:1为佳。

2.3采用响应面分析法优化香菇菌糠提取工艺

2.3.1响应面试验方案及结果分析

香菇菌糠多糖提取工艺的响应面试验方案见表2。

图4　水料比对香菇菌糠多糖提取率的影响Fig.4　Effect of water-material ratio on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

表2　响应面分析香菇菌糠多糖提取工艺设计及结果Tab.2　Response surface design and result analysis of polysaccharides from waste materials of L.edodes

2.3.2各因素间相互影响

通过3个因素相互影响分析作用，见图5（A～F）。3个因素对响应值的影响的大小为：X1提取时间＞X3水料比＞X2提取温度。

2.3.3方程求解及最佳条件

用各个因素与响应值作回归拟合，所得回归方程如下：

Y=0.055946+0.0007620X1+0.001257X2+0.0009183X3+ 0.0005045X1X3+0.001424X1X2-0.003051X2X3-0.002932X12-0.001342X22-0.002854X32

对回归方程取一阶偏导等于零并求解，确定最佳工艺因素的值，整理得如下：

图5　各因素间的相互作用对香菇菌糠多糖提取率的影响Fig.5 Interaction between various factors on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

解方程组得：X1=83.676℃、X2=5.619 h、X3= 55.152∶1（mL∶g）。为便于试验实际操作，研究时将香菇菌糠多糖最佳的提取工艺参数条件进行修正，确定提取温度为84℃、提取时间6 h、水料比55∶1（mL∶g），以便于后续实际操作。

2.3.4响应面理论值的验证

采用软件优化得出香菇多糖提取的最佳理论工艺条件，但为了验证香菇菌糠多提取率RSM优化法最大理论值可靠性，研究开展了验证试验，验证试验综合考虑试验条件，实际情况选取提取温度84℃、提取时间6 h、水料比55∶1（mL∶g），并进行3次平行试验，平均实际提取率5.61%，与理论预测提取率5.35%比较，误差为3%，由此可见采用RSM优化提取条件参数是准确可靠的。

3　结论

采用蒽酮法对香菇菌糠多糖提取的工艺优化条件为提取温度84℃、提取时间6 h、水料比55.152∶1（mL∶g），试验预测值为5.35，通过验证结果（香菇多糖提取率5.61%。）表明，优化出的香菇多糖配比工艺条件准确、可靠，可为大量香菇菌糠多糖提取提供参考，减少菌糠浪费，实现菌糠循环再生利用。

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Optimization of Extraction Processing of Polysaccharide from Waste Materials of Lentinus edodes

ZHAO Chun-yan1,XIONG Yong2,GAO Guan-shi1,WU Su-rui1
(1.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives,Kunming 650221,China; 2.Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry/State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education,Yunnan University of Nationalities,Kunming 650500,China)

To optimize the extraction processing of polysaccharide from waste materials of Lentinus edodes,single-factor experiment and response surface methodology(RSM)with three factors and three levels experiments according to the principles of Box-Behnken have been carried out.The results showed the highest extraction ratio(5.61%)of polysaccharide was obtained at 84℃,with extraction 6 h and water-material ratio of 55:1(mL·g-1).The optimization of extraction processing of polysaccharide could improve extraction rate of polysaccharide from lentinan.

Lentinus edodes;waste material;polysaccharide;esponse surface methodology(RSM)

S646.1A1003-8310（2015）05-0063-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.016

科技部国家科技支撑计划项目（2012BAD36B02）；云南省科技创新人才计划（2008OC008）。

赵春艳（1979-），女，硕士，助理研究员，主要从事食用菌遗传资源研究。E-mail:99558737@qq.com

**通信作者：吴素蕊（1978-），女，硕士，副研究员，主要从事食用菌开发利用研究。E-mail:wusurui@163.com

2015-07-10