肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147诱导单核细胞分泌TNF-α和IL-8

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(衡阳市中心医院检验科，湖南 衡阳 421001)

肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147诱导单核细胞分泌TNF-α和IL-8

吴华，卿文衡，刘军，张黎黎

(衡阳市中心医院检验科，湖南 衡阳 421001)

目的探讨肺炎嗜衣原体(Cpn)包涵体膜蛋白Cpn0147诱导人单核细胞分泌炎症因子的分子机制。方法用去除内毒素活性的不同浓度Cpn0147重组蛋白(1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL)刺激THP-1细胞0～48 h，ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)的分泌水平；实时定量PCR检测TNF-α和IL-8 mRNA的表达；用Toll样受体2(TLR2)和TLR4中和抗体处理THP-1细胞，或采用TLR2和TLR4 siRNA沉默其表达，ELISA检测THP-1处理前后TNF-α和IL-8分泌的变化。结果Cpn0147可诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-8的mRNA和蛋白；同时，不同时间点Cpn0147对TNF-α和IL-8的诱导水平有所不同，Cpn0147作用2～6 h后即可诱导TNF-α和IL-8分泌，12 h时达到峰值，随后逐渐下降。采用TLR2和TLR4中和抗体封闭THP-1细胞后，TNF-α和IL-8分泌水平明显减少，采用TLR2和TLR4 siRNA干扰其表达后，TNF-α和IL-8的分泌也得到了类似的结果。结论Cpn0147 可能通过TLR2和TLR4介导TNF-α和IL-8分泌。

肺炎嗜衣原体； Toll样受体2； Toll样受体4； 肿瘤坏死因子-α； 白介素-8

肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumonia,Cpn)是一种严格细胞内寄生、具有独特发育周期的原核细胞型微生物。作为一种常见的呼吸系统感染因子，Cpn除可引起呼吸道的急、慢性感染、支气管炎和哮喘等呼吸系统疾病外，还和动脉硬化等多种慢性疾病相关[1]。Cpn的致病机制目前尚未完全明了，但其感染所致的炎症反应是多种疾病的发病基础。研究表明，衣原体包涵体膜蛋白在致病过程中发挥重要作用。它不但可激活单核/巨噬细胞、内皮细胞而发挥促炎作用，同时也可通过TLR2和TLR4诱导T细胞增值，并能促进衣原体对宿主细胞的黏附、侵袭，或参与其免疫逃避等过程[2,3]。因此，研究包涵体膜蛋白的功能，对了解其在衣原体致病中的作用具有重要意义。Cpn0147是本课题组鉴定出的一种包涵体膜蛋白。前期研究表明，Cpn0147基因高度保守，并具有良好的免疫原性[4]，但其对宿主细胞是否具有促炎活性目前尚未完全明了，本研究旨在观察体外重组蛋白能否诱导单核细胞分泌细胞因子，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1试剂pGEX-6p-2载体原核表达重组菌由南华大学病原生物学研究所保存；人单核细胞THP-1购自ATCC。HRP标记的兔抗小鼠IgG、Amicon? Ultra-15蛋白超滤管购自Millipore；抗TLR2和TLR4中和抗体购自Novus Biologicals；Ni-NTA Spin Kit购自Qiagen公司；TNF-α和IL-8 ELISA检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Invitrogen；TLR2和TLR4 siRNA购自Santa Cruz。siRNA转染试剂盒购自Qiagen。

1.2无内毒素的Cpn0147的制备与细胞培养按照本课题组前期方法对Cpn0147进行大规模诱导表达[4]。利用去内毒素纯化柱过柱后，采用蛋白超滤管对其进行浓缩、测定浓度后低温储存备用。THP-1细胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素，4.5 mg/mL L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，于37 ℃，5% CO2条件下培养。2～3天换液一次，待细胞生长至密度为80%时，根据不同的实验目的，细胞加入不同浓度的1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL作用0～48 h。

1.4细胞因子检测细胞经Cpn0147处理结束后，离心弃上清，采用连续冻融2次以充分裂解细胞。1 000 rpm离心10 min后，获取上清测定TNF-α和IL-8含量。操作方法按照试剂盒提供的双抗体夹心法进行。通过测定450 nm处的吸光度值，并根据标准曲线计算分泌至细胞外的TNF-α和IL-8含量。

1.5实时定量PCR检测TNF-α和IL-6 mRNA表达根据试剂盒操作步骤提取细胞总RNA，并取3 μg的RNA进行逆转录，将获得的cDNA进行实时定量PCR。本文所用引物如下：TNF-α上游引物为5′-GCCCAGGCAGTCAGATCATC，下游引物为5′-CGGTTCAGCCACTGGAGCT-3′;IL-8上游引物为5′-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3′；下游引物为5′-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3′；GAPDH上游引物为5′-ACCAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游引物为：5′-TGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′，在定量PCR仪(ABI 7500)上按以下程序扩增：95 ℃ 2 min，随后按照以下程序扩增40个循环：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。PCR结束后计算各处理组中HO-1的相对表达量，计算公式：2-ΔΔCt，ΔΔCt=实验组(CtTNF-α/IL-8-CtGAPDH)-对照组(Ct TNF-α/IL-8-CtGAPDH)。

1.6细胞转染siRNA转染前，THP-1细胞更换为无血清培养基同步18h，随后将其接种于6孔板中(密度约为5×105/mL)。siRNA转染按照Qiagen公司的试剂盒操作步骤进行，将100 nmol/L TLR2或TLR4 siRNA或对照siRNA与转染试剂混合后孵育18 h。随后更换为完全培养基用于下一步研究。

1.7 Western blot 采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(25 mmol/L Tris-HCl pH7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，1% SDS)裂解细胞，并用Bradford法于595 nm波长处测定蛋白浓度。取等量蛋白经8%～10% SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，分别加入一抗和HRP标记二抗孵育，ECL显影。

2 结 果

2.1 Cpn0147诱导THP-1细胞TNF-α和IL-8 mRNA的表达THP-1细胞基础状态下TNF-α和IL-8表达量很低。当分别给予1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL Cpn0147刺激细胞8 h后，实时定量PCR结果显示TNF-α和IL-8 mRNA表达量随着Cpn0147浓度的递增而增加(图1)。

2.2 Cpn0147诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-8

ELISA结果显示，未经刺激的THP-1细胞TNF-α和IL-8分泌水平很低。经不同浓度重组Cpn0147刺激后12 h后，细胞上清中TNF-α和IL-8分泌水平显著增高，其中50 μg/mL Cpn0147作用后，TNF-α和IL-8含量分别达(486.34±33.62)pg/mL和(125.47±16.08)pg/mL(图2)。

图1 不同浓度Cpn0147诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-8 mRNA 与对照组(0 μg/mL)相比，*：P<0.05，**：P<0.01

图2 不同浓度Cpn0147诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-8 与对照组(0 μg/mL)相比，*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 Cpn0147诱导TNF-α和IL-8依赖持续的转录和翻译不同浓度的RNA合成抑制剂放线菌素(ActD)和翻译水平的抑制剂放线菌酮(CHX)预处理THP-1细胞后，ELISA结果显示，TNF-α和IL-8分泌显著降低(图3)。

图3 放线菌素和放线菌酮对Cpn0147诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-8的影响 与Cpn0147(50 μg/mL)相比，*：P<0.05

2.4 Cpn0147不同时间诱导TNF-α和IL-8分泌

不同时间点Cpn0147对TNF-α和IL-8的诱导水平有所不同，Cpn0147作用2～6 h后即可诱导TNF-α和IL-8分泌，12 h时达到峰值，随后逐渐下降(图4)。

图4 Cpn0147不同时间诱导TNF-α和IL-8分泌

2.5 TLR2和TLR4中和抗体抑制TNF-α和IL-8分泌THP-1细胞与5 μg/mL TLR2或TLR4抗体预孵育1 h，随后加入50 μg/mL Cpn0147刺激12 h，结果显示TLR2和TLR4中和抗体处理后，TNF-α和IL-8分泌水平明显降低(图5)。

图5 TLR2和TLR4中和抗体对Cpn0147诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-8的影响 与Cpn0147(50 μg/mL)相比，*：P<0.05

2.6沉默TLR2和TLR4表达下调TNF-α和IL-8分泌采用siRNA转染THP-1细胞，分别使其沉默TLR2和TLR4表达(图6A)。随后加入50 μg/mL Cpn0147刺激12 h，结果显示RNA干扰TLR2和TLR4表达后，TNF-α和IL-8分泌水平明显降低(图6)。

3 讨 论

图6 TLR2和TLR4 siRNA对Cpn0147诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-8的影响 与对照siRNA(Con)相比，*：P<0.05

相对其他致病性较强的病原微生物(如沙眼衣原体)而言，Cpn毒力相对较低，其感染人体后并不直接导致严重的病理损伤。但如果Cpn慢性持续性感染后，可诱导宿主细胞产生多种促炎细胞因子以及炎性相关介质的产生，从而造成持续的炎症反应[5]。Cpn0147为本课题组近期鉴定出来的一种包涵体膜蛋白，它定位于包涵体上，并且具有非常强的抗原性和免疫原性[4]。包涵体膜是宿主细胞进行物质和信号转导发生的重要场所，其膜蛋白参与了衣原体的生长与致病过程[3]。由于炎症是机体感染Cpn后所产生的一种免疫反应，它在发挥保护性防御反应的同时，也参与了Cpn所致的病理损伤[6,7]。为检测Cpn0147是否为一种炎症诱导物，本研究采用去除内毒素的纯化重组蛋白Cpn0147以不同剂量、不同作用时间体外刺激单核细胞系THP-1，采用ELISA和实时定量PCR对TNF-α和IL-8蛋白以及mRNA的表达进行了观察。结果显示，Cpn0147与阴性对照组相比，可显著诱导TNF-α和IL-8的产生，并呈现一定的剂量依赖关系，在1～50 μg/mL范围内，随着Cpn0147蛋白浓度的增高，TNF-α和IL-8分泌水平也逐渐升高。并且在50 μg/mL Cpn0147作用8～12 h后，培养上清中TNF-α和IL-8水平达到最峰值，然后逐渐下降。而采用RNA合成抑制剂放线菌素和翻译水平的抑制剂放线菌酮处理后，TNF-α和IL-8的分泌明显降低，这表明Cpn0147诱导其分泌依赖持续的转录和翻译。TNF-α是具有多种生物学效应的促炎细胞因子之一，在炎症反应过程中出现最早，能通过与靶细胞膜上的受体结合后，可实现其抗感染与免疫调节功能，同时还可以进一步促进IL-lβ和IL-6的合成以增强组织细胞敏感性。此外，也有研究证实高胆固醇高脂血症男性患者颈动脉斑块内可以检测到高浓度的Cpn和TNF-α，这也提示Cpn感染以及TNF-α与心脑血管疾病有关[8]。IL-8是CXC 家族重要的趋化因子，它可诱导中性粒细胞粘附并渗出至炎症部位，最终促进中性粒细胞产生呼吸爆发，释放各种蛋白水解酶和产生大量的氧自由基，参与局部炎症部位[9]。

衣原体感染后，机体免疫系统主要通过Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)对其进行识别。有研究显示，衣原体热休克蛋白60可能通过TLR4/MAPKs途径诱导血管平滑肌细胞增生[10]，在识别Cpn过程中，TLR2可能发挥更重要的作用[11]。 为了进一步观察Cpn0147诱导TNF-α和IL-8分泌是否与TLR有关，本研究首先采用TLR2和TLR4中和抗体预处理细胞，结果显示通过抗体封闭TLR2和TLR4后，TNF-α和IL-8分泌显著降低。随后采用siRNA沉默TLR2和TLR4后，也得到了类似的结果。目前有关Cpn重组蛋白与TLR的关系，还存在争议，其原因主要在于重组Cpn0147制备过程中虽然有被内毒素污染的可能[6]，但本研究在纯化Cpn0147过程中，采用了去内毒素纯化柱进行纯化，并采用鲎试剂对纯化产物进行了检测，其水平在60 pg/mL以下。这表明Cpn0147被内毒素污染的可能性很小。

总之，Cpn所致炎症反应是一种复杂的生理和病理过程，一方面它是机体清除衣原体感染所必须，另一方面，过度的炎症反应也是导致病理损伤的重要因素。在该过程中，各种细胞因子网络的平衡直接决定了炎症反应的最终结局。如何在两者之间寻求平衡是今后研究工作所面临的复杂问题。

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Chlamydophilapneumonia-DerivedInclusionMembraneProteinCpn0147InducesMonocytesSecretionofTNF-αandIL-8

WU Hua,QING Wenheng,LIU Jun,et al

(Theclinicallaboratory，CenterHospitalofHengyangCity;Hengyang,Hunan,421001,China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of the inclusion membrane protein Cpn0147 on the secretion of cytokines in monocytes.MethodsCultured THP-1 cells were stimulated with different concentration of endotoxin-free recombinant inclusion protein (1.0,10.0,30.0 and 50.0 μg/mL) for 0～48 h.Secretion of TNF-α and IL-8 were detected by ELISA,expression of the mRNA was measured by real-time PCR.In addition,cells were preincubated with Toll-like receptor 2(TLR2) or TLR4 neutralizing antibody,or transfected with siRNA for TLR2 and TLR4,secretion of TNF-α and IL-8 were detected by ELISA.ResultsCpn0147 could induce THP-1 cells the secretion of TNF-α and IL-8,and the expression of mRNA.The production of TNF-α and IL-8 varies with time intervals,the ELISA results indicated secretion of cytokines appeared after 2～6 h of stimulation,peaked at 12 h and then decreased.Pre-incubation of TLR2 or TLR4 neutralizing antibody significantly abrogate Cpn0147-induced cytokines production,similar results was also obtained by RNA interference of TLR2 and TLR4.ConclusionCpn0147 can induce TNF-α and IL-8 secretion via TLR2 and TLR4.

Chlamydophila pneumonia; Toll-like receptor 2; TLR4; TNF-α; IL-8

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.004

2015-09-10；

2015-11-10

湖南省卫生厅科技计划项目(B2013-132).

*通讯作者，E-mail：Wuhua924@163.com.

R392.12

A

(此文编辑：秦旭平)