神经调节蛋白1对大鼠缺血心肌的保护作用

2015-12-25 02:07:30武汉大学人民医院麻醉科武汉430060武汉大学心血管病研究所通讯作者mailwanglongwhu63com
山西医科大学学报 2015年9期
关键词:心梗预处理心率

周 芹,王 晞,王 龙(武汉大学人民医院麻醉科,武汉 430060;武汉大学心血管病研究所;通讯作者,E-mail:wanglongwhu@63.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心力衰竭的重要原因之一。AMI早期给予有效的药物治疗不仅能改善心功能,延缓心力衰竭,抑制心肌重构,还可明显降低死亡率。因而改善AMI后心功能和心室重构的研究越来越受到研究者们的关注。

近年的研究发现,神经调节蛋白1(neuregulin-1,NRG-1)有多种心血管生物学效应[1],包括抑制炎症,调节细胞结构功能、增殖与凋亡等。TLR4(toll like receptor 4,TLR4)是引发炎症反应的关键跨膜蛋白,广泛分布于心肌细胞和血管内皮细胞等,研究发现TLR4基因缺陷型小鼠心肌损伤相关的炎症反应较轻[2,3],抑制 TLR4 的表达能产生保护性的结果[4]。目前NRG-1抑制炎症介质,对心肌梗死大鼠的心肌保护作用是否与TLR4相关未见研究报道,故本研究通过建立大鼠急性心肌梗死模型,探讨神经调节蛋白1对大鼠缺血心肌的保护及对梗死心肌TLR4 mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年SD雄性大鼠30只,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,体重250-300 g,随机分为心梗模型组(MI组,n=12)、NRG-1预处理组(NRG组,n=12)及假手术组(sham组,n=6)。NRG组结扎左前降支建立心梗模型,于建模前30 min按0.01 μg/g经鼠尾静脉注射重组人神经调节蛋白(rh-NRG-1,sigma公司,RD5897-NR-050);MI组结扎左前降支建立心梗模型;sham组于建模时仅开胸暴露冠脉而不结扎,后两组均于手术前30 min给予等量生理盐水尾静脉干预。各组均于术后24 h取左心室。

1.2 心肌梗死模型的建立

成年SD雄性大鼠,体重250-300 g,术前禁食12 h,自由饮水。给予腹腔注射1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉。将大鼠仰卧位固定于手术台,分别将4个针形电极置于四肢皮下,采用BIOPAC16导生理记录仪记录Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVR、aVF导联心电图。行气管插管,使用小动物呼吸机调整呼吸参数(呼吸频率:70次/min,呼吸比1∶1)维持大鼠呼吸。于大鼠左侧胸部碘伏消毒,铺无菌洞巾。胸壁左旁正中切开皮肤,钝性分离筋膜和肌肉,钳夹断开左侧3、4肋骨,开胸器撑开肋骨以利于手术视野充分暴露。以眼科剪纵行剪开心包,充分暴露心脏后,于左心耳下缘与肺动脉圆锥间的冠状动脉处(约在左心耳下缘3-4 mm),用5-0缝线结扎冠状动脉左前降支。结扎部位以下心肌颜色变暗,搏动幅度减弱,心电图显示肢体导联心电图ST段抬高大于2 mm(以心电图Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段抬高0.2 mv作为手术成功标志),表明心肌梗死模型成功。最后逐层关胸。

1.3 记录心率及心肌梗死面积测定

术后24 h,再次经腹腔麻醉大鼠,接呼吸机并记录各组大鼠心率后,模型组与预处理组随机取6只大鼠开胸摘取心脏,在冰盐水内清洗残血,除去心房及右心室。-80℃冰冻心室5 min,沿结扎水平至心尖纵向将左心室均匀切成4-5片(厚度为1 mm)后,浸入1%TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)溶液中,37℃避光孵育30 min,未梗死心肌显红色,梗死区心肌未着色。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量心肌梗死面积百分比(心肌梗死面积之和/心肌总面积之和×100%)。

1.4 心肌Toll样受体4 mRNA表达检测

以real time-PCR方法检测术后24 h三组大鼠(各6只)梗死区心肌标本。采用Invitrogen Biotechnology Co.LTD中国公司合成的心肌Toll样受体4 mRNA引物,序列为 5'-GCTCTGGCATCATCTTCATTGT-3',片段长度为215 bp。内参基因β-actin引物序列为5'-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3',片段长度为240 bp。以Trizol试剂抽提心肌组织总RNA,对其进行反转录及实时荧光定量PCR反应,95℃预变性10 min,95℃延伸15 s,60℃延伸60 s,循环40次,溶解曲线从75℃至90℃,每20 s升高1℃。以β-actin进行标准化,由随机软件计算出Ct值与拷贝数。以假手术组为对照,比较各组大鼠梗死区心肌TLR4 mRNA相对表达水平。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死模型建立及心率的监测

如图1所示,心电图Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段抬高>0.2 mV,表示心梗模型建立成功。模型建立24 h后各组大鼠心率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

图1 建立心梗模型时大鼠心电图Figure 1 The ECG of rats during myocardium ischemic model establishment

表1 各组大鼠心梗后24 h心率与心梗面积百分比结果(n=6,±s)Table 1 The heart rate and infarct size percentage of rats after 24 h myocardial ischemia in each group(n=6,±s)

表1 各组大鼠心梗后24 h心率与心梗面积百分比结果(n=6,±s)Table 1 The heart rate and infarct size percentage of rats after 24 h myocardial ischemia in each group(n=6,±s)

与心梗模型组比较,*P<0.05

分组 心率(次/min) 梗死面积百分比(%)339.50 ±12.63 -心梗模型组 351.33 ±13.29 21.52 ±5.89 NRG-1 预处理组 344.83 ±13.88 15.18 ±3.98假手术组*

2.2 心肌梗死面积

心梗后24 h,心梗模型组及NRG-1预处理组大鼠心肌梗死面积百分比分别为(21.52±5.89)%和(15.18 ±3.98)%,与心梗模型组比较,NRG-1 预处理组大鼠心梗面积明显减小,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。两组大鼠心肌TTC染色见图2。

图2 心梗模型组及NRG-1预处理组大鼠梗死面积TTC染色图Figure 2 The infarct size of rats in MI group and NRG group by TTC staining

2.3 各组梗死区心肌TLR4 mRNA表达检测结果

Real-time PCR结果显示,与假手术组相比,心梗模型组Toll样受体4 mRNA的表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,NRG-1预处理组Toll样受体4 mRNA的表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.01,见图3)。

图3 各组大鼠梗死区心肌TLR4 mRNA表达水平检测结果(n=6)Figure 3 TLR4 mRNA expression level of myocardial infarction area in each group(n=6)

3 讨论

本实验研究发现大鼠建立急性心肌梗死模型24 h后,梗死区心肌Toll样受体4 mRNA表达水平增加,这与其他研究者的结果一致[5,6]。心肌梗死后,机体启动修复与炎症反应密不可分,然而炎症反应的强度和持续时间又会对已受损心肌造成损伤。Toll样受体(TLR)是固有免疫系统中特异的Ⅰ型跨膜受体及病原模式识别受体。经研究证实TLR2、TLR4及TLR6表达于人类心脏,其中TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白,广泛分布于淋巴细胞、单核巨噬细胞、心肌细胞和血管内皮细胞等[7]。TLR4激活后可引起NF-κB活化转位进核,激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路,进一步引起下游炎性因子的过度释放,如IL-1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α等,促进炎症的发展[8],促使心肌细胞凋亡。有学者报道了TLR4突变鼠心肌梗死后更少发生左心室重塑,从而保护左心室功能,而且非梗死区间质纤维化和心肌肥厚也较少发生[9]。另有研究报道,经左前降支动脉短暂阻塞后TLR4突变鼠梗死面积降低,同时心肌中性粒细胞浸润和补体沉积均有减少[3],可见阻断TLR4的表达可能抑制下游炎性因子的过度释放从而保护受损心肌。

Neuregulin-1(NRG-1)神经调节蛋白,也称为神经胶质生长因子(glial growth factor,GGF)或乙酰胆碱受体活性诱导蛋白(acetylcholine receptor inducing activity protein,ARIA),是一类表皮生长因子类蛋白[10],通过诱导ErbB受体构象改变,使ErbB蛋白形成二聚体,继而激活酪氨酸激酶,从而激活下游一系列信号通路,参与多种生理病理过程。2000年部分接受抗ErbB2单克隆抗体Trastuzumab(赫赛汀)治疗的乳腺癌患者被发现出现心功能不全[11,12],于是Neuregulin-1及其受体在心血管系统的作用逐渐受到关注。研究者发现在缺氧复氧条件下,心脏内皮细胞表达并释放NRG可减少离体成年小鼠心室肌细胞的凋亡,而心脏内皮细胞NRG基因敲除或沉默则取消了这种保护作用,证实了NRG对心肌局部缺血性损伤具有重要保护作用[13]。近年来研究发现,Neuregulin-1与受体结合激活酪氨酸激酶,活化其下游信号通路可发挥多种心血管生物学效应,包括调节心肌细胞的结构功能及增殖凋亡,保护内皮细胞促进血管新生等[1,14]。此外还有研究表明,给心肌梗死大鼠静脉注射重组NRG-1能改善心功能,上调心脏肌球蛋白轻链激酶(cMLCK)表达,保护受损心肌[15]。NRG-1的抗炎作用起初是在神经系统相关研究中被发现。在缺血性脑损伤后给予外源性NRG-1干预,通过脑组织中DNA片段化分析,发现NRG-1保护作用与IL-1β的mRNA水平抑制相关,即NRG-1可抑制炎性因子IL-1β的表达[16]。通过检测炎症因子相关基因证明了在缺血性脑损伤大鼠模型中NRG-1的抗炎作用[17]。在小鼠实验性脑型疟疾模型中NRG-1的干预可以减少脑组织前炎因子 TNF-α、IL-6、IL-1β 的水平[18]。

本研究结果显示造模前给予rhNRG-1对心梗大鼠心率无明显作用,但可以减少大鼠心肌梗死面积,同时降低心肌TLR4的mRNA水平。结合以上研究,我们初步推测 NRG-1可能通过下调心肌TLR4表达,抑制其下游炎性因子的进一步激活,从而减轻炎症反应保护缺血心肌,减少心梗面积。近年来NRG-1有关心血管方面的研究让学者们看到了其潜在的临床应用前景,目前已有Ⅱ期临床研究证实NRG-1可改善慢性心衰患者心功能,临床运用安全耐受性较好[19]。然而NRG-1是直接作用于心肌Toll样受体4,下调 TLR4的 mRNA水平,其对TLR4蛋白水平的影响是如何,是否还作用于其他通路抑制TLR4的表达,亦或是作用于其他靶点,其多重生物学效应的机制仍需进一步深入研究。

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