刺五加多糖的提取工艺研究

陈芬芳， 于红梅， 王 瑞， 褚秀玲， 苏建青

（聊城大学农学院，山东聊城 252000）

刺五加为中国东北多年生落叶灌木，性温、味辛、微苦、无毒，入脾肾经，具有祛风除湿、舒筋活血、益气健脾、补肾安神之功效。现代药理试验研究证实，中草药刺五加中含有皂苷、黄酮、多糖、微量元素和氨基酸等有效成分，具有增强机体抵抗力、抗疲劳和抗氧化等功效（王瑞强等，2013；田志浩等，2013）。刺五加多糖是从中草药刺五加的根和茎中提取出的一种中草药多糖 （龚婧如和王书芳，2012）。研究显示，刺五加多糖具有增强免疫力、抗氧化和促进生长等功效。本试验采用热水浸提法从刺五加中抽提多糖，通过单因素试验和正交试验优化其提取工艺。

1 材料和方法

1.1 材料 刺五加饮片，购于聊城利民大药房，60℃温箱烘干后粉碎，过40目筛备用。葡萄糖、苯酚、浓硫酸，均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 刺五加多糖含量的测定 刺五加多糖的测定方法采用苯酚-硫酸法，按照姜琼和谢妤（2013）的方法略有修改。

1.2.1.1 标准品溶液的配制 100 μg/mL的葡萄糖溶液：将葡萄糖置于105℃的干燥箱内烘干至恒重，精密称取10.0 mg至100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解混匀，定容。

6%苯酚溶液：精密称取6.0 g苯酚，用蒸馏水溶解，定容至100 mL，混匀，装入棕色瓶中，4℃避光保存。

1.2.1.2 葡萄糖标准曲线的绘制 吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的葡萄糖标准溶液，分别加入9支10 mL的具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，然后每个试管中分别加入6%苯酚溶液1.0 mL，最后每个试管沿管壁迅速加入7.0 mL浓硫酸，摇匀，静置10 min后放入80℃水浴中恒温15 min，放置室温冷却。将第一个试管样品作为空白对照，在波长490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析。

1.2.2 刺五加多糖提取的单因素试验 刺五加多糖的提取采用热水浸提法，每次称取1.0 g刺五加粉末，加入烧瓶中，按料液比加入蒸馏水，浸泡30 min后，在水浴锅中进行加热。分别考察提取时间、提取温度、料液比和提取次数4个因素对刺五加多糖提取率的影响。

1.2.2.1 提取时间对刺五加多糖提取率的影响提取时间分别选择 1.0、1.5、2.0、2.5 h 和 3.0 h，料液比、提取温度和提取次数分别固定为1∶25、80℃和2次。将2次的提取液合并，在波长490 nm处测定吸光度（A）值。根据1.2.1的标准曲线计算刺五加多糖的含量。

1.2.2.2 提取温度对刺五加多糖提取率的影响提取温度选择50、60、70、80℃和90℃，料液比、提取时间和提取次数分别固定为1∶25（g/mL）、2 h和2次。将2次提取液合并，分别测定不同提取温度下多糖的含量。

1.2.2.3 料液比对刺五加多糖提取率的影响 料液比选取 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 和 1∶35 （g/mL），提取温度、提取时间和提取次数分别固定为80℃、2 h和2次。将2次提取液合并后，测定刺五加多糖的含量。

1.2.2.4 提取次数对刺五加多糖提取率的影响提取次数选择1次、2次和3次，提取温度、提取时间和料液比分别固定为 80 ℃、2 h 和 1∶25（g/mL）。提取后分别测定不同提取次数的提取液刺五加多糖的含量。

1.2.3 刺五加多糖提取的正交试验 根据刺五加多糖提取的单因素试验结果，以提取时间、提取温度、料液比、提取次数为考察因素，设计四因素三水平正交试验，优化提取条件，并采用SPSS 13软件对正交试验结果进行极差分析和方差分析。正交试验因素与水平见表1。

表1 L9（34）正交试验因素与水平

1.2.4 验证性试验 根据正交试验获得的最佳提取工艺条件对刺五加多糖进行提取，重复3次，分别计算多糖的提取量，考察该条件下提取刺五加多糖的提取率及变异系数，以确定试验结果的可行性和准确性。

2 结果与分析

2.1 多糖测定方法的建立 以葡萄糖配制标准溶液，采用苯酚-硫酸法测定不同浓度的葡萄糖溶液在490 nm处的吸光值，绘制标准曲线。不同浓度的标准葡萄糖溶液与其对应吸光值的线性回归直线如图1所示，线性拟合方程为A=0.6653C-0.0025，R2=0.9975，试验表明，葡萄糖溶液浓度在0.01～0.08 mg/mL与吸光度值呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖溶液标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对刺五加多糖提取率的影响 由图2可知，在1.0～2.0 h，刺五加多糖的提取率随提取时间的延长而增加，最高达到18.18 mg/g，但是超过2.0 h后，多糖的量逐渐减少。分析原因可能是刺五加多糖发生了水解，或随着提取时间的延长，刺五加中的其他杂质成分亦被提取出来，干扰了刺五加多糖的溶解量。因此，选定2.0 h作为单因素试验的最佳提取时间。

图2 提取时间对刺五加多糖提取率的影响

2.2.2 提取温度对刺五加多糖提取率的影响 由图3可知，当提取温度超过60℃以后，刺五加多糖的提取率随温度的升高而增加，但是在70～90℃，多糖提取率的增幅趋于平缓，70、80、90℃的提取率分别是 16.93、17.05、18.02 mg/g。 考虑到高温会引起多糖的变性分解，因此选择80℃作为单因素试验的最佳提取温度。

图3 提取温度对刺五加多糖提取率的影响

2.2.3 料液比对刺五加多糖提取率的影响 由图4 可知，料液比在 1∶15～1∶25（g/mL）时，刺五加多糖的提取率是逐渐增加的，1∶25（g/mL）时多糖的提取率达到了 16.87 mg/g， 但是超过 1∶25（g/mL）以后，多糖的提取率反而下降。因此，选择最佳的料液比为 1∶25（g/mL）。

图4 料液比对刺五加多糖提取率的影响

2.2.4 提取次数对刺五加多糖提取率的影响 通常随着提取次数的增加，多糖的提取率逐渐升高。由图5可知，提取1次、2次和3次，多糖的提取量分别是12.59、19.77、22.36 mg/g。所以，选择3次作为最适提取次数。

图5 提取次数对刺五加多糖提取率的影响

2.3 正交试验结果 正交试验与方差分析结果见表2和表3。通过极差分析显示提取温度的R值最大，为4.941，其次是提取次数。根据R值的大小判定，4个因素对提取率的影响顺序为提取温度＞提取次数＞料液比＞提取时间。通过方差分析可知，F（A）＜ 0.05，F（B）＜ 0.05，即提取次数和提取温度对刺五加多糖的提取率影响显著。因此，最佳提取方案确定为A3B3C2D3，即提取次数为3次，提取温度为 90 ℃，料液比为 1∶25（g/mL），提取时间为 2.5 h。

2.4 验证性试验结果 在提取温度90℃、料液比为 1∶25（g/mL）、提取时间 2.5 h、提取次数 3 次时，刺五加多糖的提取率为23.95 mg/g，RSD为1.98%（n=3），明显高于市场平均水平，故该条件即为刺五加多糖的最佳提取工艺。

3 讨论与结论

刺五加是长白山地区大宗地道中药材，其药用价值高，需求量较大。传统的饮片利用浪费较大，对刺五加原药材有效成分的提取和研究，可提高药材利用效率。刺五加多糖具有免疫增强和抗疲劳、抗氧化作用，是理想的免疫增强剂（刘树民和张娜，2014）。如能对刺五加及其有效成分——刺五加多糖进一步提取和纯化，提高其纯度，将对刺五加制剂的研究及临床疗效产生巨大的影响。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

由于影响刺五加多糖提取的主要因素有料液比、提取温度、提取时间、提取次数和炮制方法等（孟凡欣等，2005）。本试验重点考察了料液比、提取温度、提取时间和提取次数对刺五加多糖提取率的影响，并利用正交试验优化了刺五加多糖的提取工艺条件，在最佳提取工艺条件下获得的多糖含量达到23.95 mg/g。

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[3]刘树民，张娜.刺五加多糖的现代研究进展[J].中医药信息，2014，31（2）：116～119.

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