环磷酰胺对大鳞副泥鳅免疫抑制的研究

陈亚军， 李 义， 徐 乐， 凌去非， 葛星星

（苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州 215123）

免疫功能正常的水产动物对病原的入侵具有较强的抵抗力，只有当机体免疫功能低下而又遭遇病原时才会患病。因此，免疫增强剂更适用于免疫功能低下的水产动物。但是，目前通常是将免疫增强剂给予正常的水产动物后测定其免疫应答水平，依据免疫水平的提高来评定免疫增强剂的效果。实际上，对于免疫功能正常者，会因机体自身免疫系统存在调节作用而掩盖免疫增强剂的真实效果（陈勇等，2005；华雪铭等，2004）。因此建立水产动物免疫抑制模型对水产动物免疫增强剂的研发具有重要的理论与实际意义。

环磷酰胺（CYP）是一种免疫抑制剂，常用于建立免疫抑制模型。目前，应用环磷酰胺已成功建立了暗纹东方鲀（华雪铭等，2004）、异育银鲫（陈勇等，2005）、蟾胡子鲇（Kumari和 Sahoo，2005）、杂色鲍（王广军等，2008）、建鲤（李其繁，2009）、黄鳝（闫琳，2010）及中华绒螯蟹（王玉芬等，2014；李义等，2014）等水产动物的免疫抑制模型。但是，由于水产动物的种类较多，免疫抑制模型的通用性较差，并且，目前有关泥鳅免疫抑制模型的研究鲜见报道。因此本文报道环磷酰胺对大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）免疫抑制的试验结果，旨在为泥鳅免疫增强剂的研发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼 大鳞副泥鳅，购自苏州奥博鳅业有限公司，外观健康，平均体重为（16.33±0.12）g。

1.1.2 试剂与基础饲料 环磷酰胺 （CYP），为Sigma公司产品；红细胞数 （RBC）、白细胞数（WBC）、补体 C3、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、考马斯亮蓝法蛋白定量测定试剂盒及溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）冻干粉，均为南京建成生物工程研究所产品；超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）含量与丙二醛（MDA）含量测定试剂盒，均为苏州科铭生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。基础饲料由本实验室自制，不含有免疫增强剂和免疫抑制剂。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 泥鳅经过1周暂养后，随机分组饲养于16只35cm×37.5cm×20cm的圆形塑料桶内，每只桶放养18尾。养殖期间投喂基础饲料，水温控制在（25±0.5）℃，按常规方法进行饲养管理。试验设3个CYP组（Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组）和1个对照组，每个处理组设4个重复。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别以 100、200、300 mg/kg体重的剂量腹腔注射CYP，对照组注射等量的0.85%灭菌生理盐水。

1.2.2 样本采集 在注射CYP后第8天自每个养殖桶中随机采取3尾泥鳅，断尾取血并采集肝胰脏，按常规方法分别制成抗凝血、血清及肝胰脏匀浆上清液备用。

1.2.3 免疫指标的测定 RBC、WBC、血清NO含量、补体C3含量、ACP与AKP活性、肝胰脏SOD活性及MDA含量的测定，参照试剂盒所述方法适当修改后进行。血清LSZ活性的测定参照Hultmark和Seiner（1980）的方法适当修改后进行。以溶壁微球菌冻干粉为底物，用0.1 mol/L pH 6.4的磷酸盐缓冲液将底物配成一定浓度的菌悬液（OD570nm=0.3），取3 mL菌悬液与0.1 mL待测血清于试管中混匀，用分光光度计测定570nm处的初始吸光值（A0），然后置于37℃水浴30 min，取出后立即置于冰浴中（10 min）终止反应，测定吸光值（A）。 LSZ 活性（U）=（A0-A）/A。

1.3 统计分析 数据用统计软件SPSS18.0进行单因素方差分析，并用Duncan’s检验法进行均值间多重比较。P>0.05为差异不显著，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 环磷酰胺对大鳞副泥鳅外周血红细胞数和白细胞数的影响 由表1可知，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的RBC和WBC分别降低45.5%、56.3%、73.5%和 78.0%、59.4%、81.0%（P ＜ 0.05）；Ⅲ组的RBC分别较Ⅰ、Ⅱ组降低51.5%和39.5%（P＜0.05），Ⅰ组和Ⅱ组之间差异不显著 （P>0.05）；Ⅰ组和Ⅲ组的WBC分别较Ⅱ组降低45.9%和53.1%（P＜0.05），Ⅰ组和Ⅲ组之间差异不显著（P>0.05）。上述结果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg体重的CYP均能显著降低大鳞副泥鳅外周血中的红细胞数和白细胞数，以300 mg/kg体重剂量的作用效果最佳。

2.2 环磷酰胺对大鳞副泥鳅血清一氧化氮含量的影响 由表1可知，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的血清NO含量分别增加216.0%、52.0%、144.0%（P＜0.05）；Ⅰ组和Ⅲ组的血清NO含量分别较Ⅱ组增加107.9%和60.5%（P＜0.05），Ⅰ组和Ⅲ组之间差异不显著（P>0.05）。上述结果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg体重的CYP均能显著提高大鳞副泥鳅血清NO含量，以100 mg/kg体重剂量的作用效果最佳。

2.3 环磷酰胺对大鳞副泥鳅血清补体C3含量的影响 由表1可知，Ⅲ组的血清补体C3含量分别较对照组、Ⅰ组和Ⅱ组降低48.6%、42.8%和35.8%（P＜0.05）；Ⅰ组、Ⅱ组和对照组3个组的血清补体C3含量无显著差异（P>0.05）。上述结果表明，腹腔注射试验剂量的CYP均能降低大鳞副泥鳅血清补体C3含量，300 mg/kg体重剂量的作用最显著。

2.4 环磷酰胺对大鳞副泥鳅血清溶菌酶活性的影响 由表1可知，Ⅱ、Ⅲ组的血清LSZ活性分别较对照组和Ⅰ组降低47.8%、52.2%和40.0%、45.0%（P＜0.05）；Ⅰ组与对照组、Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著（P>0.05）。上述结果表明，腹腔注射200、300 mg/kg体重的CYP均能显著降低大鳞副泥鳅血清LSZ活性，以300 mg/kg体重剂量的作用效果较佳。

2.5 环磷酰胺对大鳞副泥鳅血清磷酸酶活性的影响 由表1可知，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的血清ACP活性分别降低33.1%、41.1%和29.0%，AKP活性分别降低 55.2%、60.3%和 47.9%（P＜0.05）；3个CYP组的血清ACP和AKP活性无显著差异（P>0.05）。上述结果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg体重的CYP均能显著降低大鳞副泥鳅血清ACP和AKP活性，均以200 mg/kg体重剂量的作用效果最佳。

表1 环磷酰胺对大鳞副泥鳅9种免疫指标的影响

2.6 环磷酰胺对大鳞副泥鳅肝胰脏超氧化物歧化酶活性的影响 由表1可知，Ⅰ组和Ⅱ组的肝胰脏SOD活性与对照组和Ⅲ组相比，分别增加44.8%、91.0%和 75.1%、131.0%（P ＜0.05）；Ⅱ组的肝胰脏SOD活性比Ⅰ组增加31.9%（P＜0.05）；Ⅲ组的肝胰脏SOD活性低于对照组，但两组之间无显著差异（P>0.05）。由此可见，腹腔注射100、200 mg/kg体重的CYP对大鳞副泥鳅肝胰脏SOD活性均具有显著的增强作用，以200 mg/kg体重剂量的作用效果较佳；腹腔注射300 mg/kg体重的CYP对泥鳅肝胰脏SOD活性具有一定的抑制作用。

2.7 环磷酰胺对大鳞副泥鳅肝胰脏丙二醛含量的影响 由表1可知，Ⅰ组和Ⅲ组的肝胰脏MDA含量与对照组和Ⅱ组相比，分别显著增加47.3%、50.8%和 33.9%、37.0%（P<0.05）；Ⅱ组与对照组、Ⅰ组与Ⅲ组之间差异不显著（P>0.05）。上述结果表明，腹腔注射100和300 mg/kg体重的CYP均能显著提高大鳞副泥鳅肝胰脏MDA含量，以300 mg/kg体重剂量的作用效果较佳。

3 讨论

红细胞数与白细胞数是反映机体免疫状况的常用指标。研究表明，腹腔注射一定剂量的环磷酰胺可显著降低小鼠（Wang等，2011）和建鲤（李其繁，2009）的RBC与WBC。本试验结果表明，对大鳞副泥鳅腹腔注射100、200、300 mg/kg体重的环磷酰胺后第8天，RBC与WBC均显著下降。这与本研究结果相一致。

NO作为一种自由基，在动物体内发挥着生理和病理的双重作用。一方面可抑制和杀灭病原微生物，参与机体抗感染免疫和防御；另一方面大剂量的NO可产生细胞毒性作用，损伤正常组织细胞（沙爱龙等，2013）。本试验结果显示，对大鳞副泥鳅腹腔注射100、200、300 mg/kg体重的环磷酰胺后第8天，血清NO含量均显著增加，表明试验剂量的环磷酰胺可能已导致泥鳅出现了免疫抑制及组织损伤。推测出现上述结果的机制可能是泥鳅在受到环磷酰胺刺激后，诱导型NO合成酶（iNOS）mRNA的表达增加，从而导致血清NO含量明显增加。陈炅然等（2005）发现，腹腔注射100 mg/kg体重的环磷酰胺可使小鼠胸腺NO水平显著上升，这与本试验结果一致。

补体系统是鱼类免疫系统的重要组成部分，其中补体C3含量的高低反应机体免疫功能的强弱。已有研究表明，环磷酰胺能显著降低小鼠（沈赤等，2015；廖吕燕等，2010）和建鲤 （李其繁，2009）血清补体C3含量。本试验结果显示，腹腔注射300 mg/kg体重的环磷酰胺能显著降低泥鳅血清补体C3含量，这与本研究结果一致。

溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子，其通过水解细菌细胞壁的肽聚糖而发挥溶菌作用。ACP和AKP是动物体内水解酶体系和解毒体系中的两种重要酶类，对机体的免疫功能具有积极的影响。已有研究表明，注射环磷酰胺可显著降低建鲤和黄鳝的血清LSZ活性（闫琳，2010；李其繁，2009）；显著降低建鲤和中华绒螯蟹血清ACP 和 AKP 活性（王玉芬等，2014；闫琳，2010）。这与本试验结果一致。

SOD活性的高低在一定程度反映了机体清除氧自由基的能力，MDA含量则反应了机体脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤的程度。已有研究表明，注射环磷酰胺能使小鼠肝组织中的SOD活性显著降低，MDA含量显著增加（Jnaneshwari等，2013；柯春林等，2011）。本试验结果显示，对大鳞副泥鳅注射试验剂量的环磷酰胺后第8天，100、300 mg/kg组的肝胰脏MDA含量显著高于对照组；100、200 mg/kg组的肝胰脏SOD活性显著高于对照组，300 mg/kg组则低于对照组。这与上述研究结果基本相同。至于本试验中泥鳅肝胰脏SOD活性的表现，也许可用 “毒物兴奋效应”（Stebbing，1982）来解释。

4 结论

对大鳞副泥鳅腹腔注射100、200、300 mg/kg体重的环磷酰胺，可使其免疫功能受到不同程度的抑制。从总体上看，以300 mg/kg体重剂量的作用效果最好，该剂量可用于构建环磷酰胺诱导的大鳞副泥鳅免疫抑制模型。

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