ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖

ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖

张艳平丁矢李雪兰杨杰唐峰欧勇

(常德职业技术学院医学系，湖南常德415100)

摘要〔〕目的针对ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖以分析癌症靶向治疗的前景。方法通过基因测序法鉴定所构建的siRNA表达载体。用四唑盐比色(MTT)法、流式细胞术评价转染siRNA后对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响。结果与NC-shRNA组相比，BHRF1-shRNA组细胞凋亡增加，凋亡率为(31.51±1.59)%。结论由慢病毒载体介导的shRNA表达载体进入细胞后，可以有效下调BHRF1基因表达水平，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

关键词〔〕慢病毒；ShRNA；靶向干扰；BHRF1基因；细胞增殖

中图分类号〔〕R739.63〔

基金项目：2012年度湖南省高等学校科学研究项目(12C0968)

通讯作者：丁矢(1979-)，女，讲师，主要从事病理学研究。

第一作者：张艳平(1971-)，女，副教授，主要从事医学免疫学与病原学研究。

目前认为鼻咽癌的发生、发展与遗传、环境和Epstein-Barr(EB)病毒感染等多因素有关，特别是与EB病毒(EBV)密切相关〔1〕。该疾病好发于中老年人群，具有较高的致残、致死率。EBV早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因编码的BHRF1蛋白是一种结构与功能都和细胞Bcl-2 同源的蛋白，很多研究〔2，3〕表明BHRF1 在EBV复制期可以抑制感染细胞的凋亡，延长细胞寿命，有利于病毒的成熟和扩散，但BHRF1基因编码的蛋白最终是通过何种途径抑制细胞凋亡的发生，从而导致细胞癌变的分子机制目前还未完全阐明。鉴于EBV BHRF1 基因与原癌基因bcl-2 同源，具有抑制细胞凋亡的作用，探讨以BHRF1 为靶点对EBV 相关鼻咽癌进行治疗的巨大潜在价值。

1资料与方法

1.1一般资料我院2010年1月至2013年12月老年鼻咽癌手术患者20例，男13例，女7例；平均年龄(65.32±3.78)岁，术中病理切片，并分离出人鼻咽癌CNE2细胞，将这些细胞分为两组，一组为BHRF1 shRNA质粒载体转染过的CNE2细胞(BHRF1-shRNA组)，一组为未进行转染的CNE2细胞(NC-shRNA组)。Trizol totalRNA试剂盒，BHRF1 shRNA序列，由Qiagen公司合成，构建靶向表达载体，应用体外转染试剂转染CNE2细胞。

1.2方法运用四唑盐比色(MTT)法绘制生长曲线。选择对数生长期细胞0.25%胰酶消化，悬浮计数，接种于96孔板，约500个/孔。慢病毒感染后置于37℃、5% CO2培养箱孵育10 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液，继续细胞培养箱内培养4 h。移除培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，低速震荡10 min，酶联免疫检测仪。570 nm处测量每孔吸光值光密度(OD)值，OD值表示细胞增殖能力大小。连续观察7 d绘制细胞生长曲线。同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，空白对照孔，每个样本设3个复孔。

运用异硫氰酸荧光素(FITC)-Annexin V/碘化丙啶(PI)双染色法测定细胞凋亡。按FITC-Annexin V/PI试剂盒操作说明，取不同时间点细胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，收集1×105～5×105细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞二次，1 000 r/min，离心5 min。加入500 μl的结合缓冲液，轻轻摇晃或者吹打，使细胞悬浮，先加入5 μl Annexin V-增强绿色荧光蛋白(EGFP)混匀后，再加入相同体积 Propidium Iodide混匀。在室温下，避光环境中，反应5～15 min。1 h内，进行流式细胞仪上样检测，激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。Annexin V-EGFP 的绿色荧光通过FITC 通道(FL1)检测；PI 红色荧光通过PI 通道(FL2 或FL3)检测。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。以β-actin为内参，运用Western印迹法分析各感染组BHRF1基因蛋白表达情况，获得各组BHRF1基因表达量，以相同观察时间点空白组细胞BHRF1基因表达量为100%，利用公式：BHRF1表达率(%)=100%×(BHRF1-shRNA组或NC-shRNA组BHRF1基因蛋白表达量/空白组hTERT 表达量)，计算各组细胞中BHRF1基因蛋白相对表达水平。酶标仪分析各组细胞，在570 nm处测量每孔吸光值OD，以空白组细胞OD值为100%，通过公式：100%×(处理组OD值/空白组OD值)。流式细胞分析选择感染后48 h作为观察时间点，流式细胞图中，右下象限(FITC+/PI-)为早期凋亡细胞，而右上象限(FITC+/PI+)是晚期凋亡细胞，凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3统计学分析采用SPSS13.0软件进行成组t检验。

2结果

2.1转染后BHRF1基因蛋白表达情况空载体组与NC-shRNA组比较，感染后0、24、48、72 h，BHRF1表达量无改变(P值均>0.05)；BHRF1-shRNA组与NC-shRNA组比较，感染后0 h，BHRF1蛋白表达量无改变(P>0.05)，感染后24、48、72 h，BHRF1表达量明显降低(P值均<0.05)。BHRF1-shRNA组表现明显时间依赖性，随着观察时间的延长，后一个观察时间点都较前一个观察时间点细胞中BHRF1表达量出现明显下降。见表1。

2.2MTT绘制生长曲线空载体组与NC-shRNA组比较，转染细胞后1～7 d，细胞增殖出现减慢趋势，但无统计学意义(P值均>0.05)。BHRF1-shRNA组与NC-shRNA组比较，感染后1 d就出现了增殖减慢趋势，但差异不显著(P>0.05)，2 d后，增殖减慢作用逐渐增强(P值均<0.05)。见表2。

2.3流式细胞检测BHRF1-shRNA对细胞凋亡的影响空载体组与NC-shRNA组凋亡率(9.68%±1.50% vs 10.53%±1.43%)差异不显著(P>0.05)。BHRF1-shRNA组(31.51%±1.59%)与NC-shRNA组、空载体组比较，凋亡作用明显增加(P<0.05)。

组别0h24h48h72h空载体组95.64±4.9096.58±3.7496.38±2.7494.59±4.52NC-shRNA组96.88±3.1396.32±2.5596.73±4.1897.46±2.14BHRF1-shRNA组96.02±2.8477.72±4.511)2)3)62.01±3.491)2)4)44.26±3.301)2)5)

与空载体组比较：1)P<0.05；与NC-shRNA组比较：2)P<0.05；与0 h比较：3)P<0.05；与24 h比较：4)P<0.05；与48 h比较：5)P<0.05；下表同

组别1d2d3d4d5d6d7d空载体组89.78±8.0583.72±9.8188.35±9.3587.26±7.9589.14±7.9788.57±6.8590.28±5.60NC-shRNA组87.16±9.2187.68±6.8588.14±9.2686.01±8.1587.16±7.8487.90±7.7188.01±8.62BHRF1-shRNA组82.58±9.2170.02±6.941)2)56.39±5.401)2)50.32±5.881)2)58.38±5.711)2)56.33±4.231)2)59.97±5.451)2)

3讨论

已有研究〔4〕以端粒酶为研究切入点，试图探索鼻咽癌新的治疗靶点和新的治疗模式。端粒酶与鼻咽癌发生发展的密切联系已被许多研究学者证实。范才文等〔5〕使用端粒重复序列扩增法(TRAP)测定了136例原发性鼻咽癌的手术切除标本中端粒酶的活性，其中癌组织中端粒酶的活性阳性率为80.1%，而邻近正常组织标本4.4%；其中小细胞鼻咽癌(SCLC)100%〔6〕。刘瑾等〔7〕首次运用meta分析结果显示，端粒酶活性阳性(标本来源于肺)者患鼻咽癌的危险性是端粒酶阴性者的66.43倍；端粒酶阳性在鼻咽癌人群中出现的概率是非鼻咽癌人群的12.13倍；端粒酶阴性在鼻咽癌人群中出现的概率仅为非鼻咽癌人群的0.22倍〔7〕。Meta分析结果显示端粒酶是一种高灵敏度和特异度的肿瘤标志物〔8〕。

无论是采用何种方式制备shRNA，都需要考虑如何将shRNA高效地导入靶细胞，采用何种基因导入系统是基因治疗的关键，这决定进入靶细胞的基因量，影响基因治疗效果。虽然可以将体外化学合成的siRNA利用阳离子脂质体阳离子脂质体(如LipofectamineTM2000)直接转染细胞，并能特异性抑制哺乳动物细胞内同源基因的表达。但双链siRNA是带负电的聚合物，难以直接通过疏水性的细胞膜〔9，10〕。且shRNA分子易被RNA酶降解。为了解决这些难题，而又不影响shRNA的生物活性，目前常采用的方法是将shRNA序列插入到质粒中，构建shRNA稳定表达载体，然后包裹在脂质体内运输。相比之下，通过构建shRNA表达载体能在细胞内长时间、稳定地生成shRNA。

慢病毒载体本身以及NC-shRNA序列不影响靶基因及其表达蛋白的改变，但会使细胞增殖速度出现减慢趋势，细胞生长受到一定程度的抑制，细胞凋亡率增加〔11，12〕。可见慢病毒颗粒对细胞有一定程度的毒性作用。针对mRNA设计的siRNA序列能特异性地与目的基因BHRF1-shRNA结合，并降解mRNA，进一步使CNE2 mRNA表达下降，引起细胞生长受到抑制，细胞增殖速度减慢，细胞凋亡增加。

4参考文献

1Yang CF，Peng LX，Huang TJ，etal.Cancer stem-like cell characteristics induced by EB virus-encoded LMP1 contribute to radioresistance in nasopharyngeal carcinoma by suppressing the p53-mediated apoptosis pathway〔J〕.Cancer Lett，2014；344(2)：260-71.

2Li Z，Chen X，Li L，etal.EBV encoded miR-BHRF1-1 potentiates viral lytic replication by downregulating host p53 in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2012；44(2)：275-9.

3Kim dN，Lee SK.Biogenesis of Epstein-Barr virus microRNAs〔J〕.Mol Cell Biochem，2012；365(1-2)：203-10.

4Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011；61(2)：69-90.

5范才文，田晶，王建红，等.Stathmin表达抑制的鼻咽癌细胞系建立〔J〕.中国现代医学杂志，2012；22(9)：43-7.

6Yang F，Zhuo L，Ananda S，etal.Role of reactive oxygen species in triptolide-induced apoptosis of renal tubular cells and renal injury in rats〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011；31(3)：335-41.

7刘瑾，杨青，兰亚佳，等.肺癌患者端粒酶表达的meta分析〔J〕.中国肺癌杂志，2001；4(4)：299-302.

8宋玉姣，韩继波，陈始明，等.腺病毒介导的shRNA沉默hTERT基因表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.肿瘤防治研究，2011；38(12)：1351-5.

9Fu Q，Jiang ZZ，Zhang LY.Impairment of triptolide on liver mitochondria in isolated liver mitochondria and HL7702 cell line〔J〕.Chin J Integr Med，2013；19(9)：683-8.

10Borja-Cacho D，Yokoyama Y，Chugh RK，etal.TRAIL and triptolide：an effective combination that induces apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.J Gastrointest Surg，2010；14(2)：252-60.

11李刚，谭晓虹.RNA干扰survivin对口腔表皮样癌细胞株KB生长的抑制作用〔J〕.肿瘤防治研究，2011；38(3)：257-60.

12Yinjun L，Jie J，Yungui W.Triptolide inhibits transcription factor NF-kappaB and induces apoptosis of multiple myeloma cells〔J〕.Leukemia Res，2005；29(1)：99-105.

〔2013-09-15修回〕

(编辑冯超)