APP/PSl双转基因阿尔海默病小鼠的繁殖及基因型鉴定*

毛敬洁 李钻芳 林如辉 卓沛元 张颖铮

（1福建中医药大学中西医结合研究院 福州350122；2福建中医药大学康复医学院 福州350122）

阿尔海默病（Alzheimer Disease，AD）是老年期最常见的中枢神经系统退行性疾病。临床表现为进行性认知障碍和神经精神异常，以大脑皮质广泛性萎缩出现大量的β淀粉样蛋白（β-amyloid Protein，Aβ）沉积形成的老年斑（Senile Plaque，SP）和异常过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangle，NFT）为典型的病理变化。发病机制涵盖遗传、环境危险因子、多种基因及致病蛋白的改变。目前认为中枢神经递质代谢障碍、APP基因突变、Aβ多肽沉积、tau蛋白过度磷酸化、炎症、氧化应激、异常的细胞周期/凋亡等是AD的主要发病机制[1～2]。APP/PS1转基因小鼠被认为是可模拟AD自然病理生理过程的理想动物模型[3～4]。众所周知，转基因鼠价格较高，为本课题研究认知障碍提供足够的动物模型，从南京大学生物医药研究院动物实验模式中心购入了APP/PS1双转基因小鼠纯合子雄性2只和野生型雌鼠2只进行繁殖。根据遗传规律所获后代有1/4的机率为阴性纯合子，所以在使用前必须进行基因型检测。现将这批小鼠的饲养、繁殖及鉴定过程报道如下：

1 材料和仪器

1.1 实验动物 由南京大学生物医药研究院动物实验模式中心提供B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9 85Dbo/J品系。双转基因小鼠纯合体雄性种鼠2只及同窝阴性雌性鼠2只，繁殖所产生后代50只1～4月龄，分笼喂养于福建中医药大学实验动物中心，SPF级。

1.2 主要试剂 小鼠组织基因组DNA提取试剂盒购自Biospin公司；引物由上海生工生物有限公司设计合成。100 bp marker（杭州博日科技有限公司）；PCR Master Mix（2X）[加拿大（中国）Fermenta公司]；琼脂糖（美国 Bio-west公司）；Gold View 染料（上海赛百盛基因技术有限公司）；6 X Loadin Buffer、5 X TBE（上海捷瑞生物工程有限公司）。无水乙醇（广州化学试剂厂分析纯）。

1.3 主要仪器 G-STORMGSI梯度PCR仪（英国GRI公司），Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统APC电泳仪、水平式电泳槽（美国Bio-Rad公司）DU-650型蛋白核酸分析仪（美国Beckman公司）5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 饲养与繁殖法 实验动物遵照国家实验动物饲养和使用指南，温度：（22±1）℃，湿度：50%，12 h/12 h明暗循环，自由饮食和饮水。小鼠的可配期为3～10个月，母鼠的妊娠期为20 d左右，繁殖采用一只雄鼠与一只雌鼠同居的方式进行。新生鼠出生后前5 d不换垫料，第19～20天后子鼠雌雄分笼饲养。

2.2 基因鉴定方法

2.2.1 剪鼠尾 当新生的小鼠年龄达到2～3周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，鼠尾剪去长度不得超过0.5 cm。此时剪尾一方面避免了在幼崽出生后一周打扰带乳母鼠，防治母鼠的吃仔现象；另外这时的小鼠容易抓取，体毛尚未生长，小鼠的出血较少恢复力比较强，提取DNA的质量较好。剪鼠尾后即对小鼠标记，一般情况下一笼小鼠不会超过10只，采用左右耳朵打洞的方法来标记，依次标记为左1、右1、左2、右 2、左 1 右 1、左 2 右 1、左 1 右 2、左 2 右 2、左3，最后一只不打洞。

2.2.2 DNA提取和定量 剪取小鼠尾巴0.5 cm放入编号的EP管中，投入液氮冷却后研磨，取50 mg粉末放入1.5 ml离心管。用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA。在50 mg组织中加入600 μl的RL Buffer用1 ml的Tip头轻轻吹打混合均匀后，于6 000 r/min离心1 min，弃上清；加10 μl PK Solution和200 μl LT Buffer混合均匀；于56℃环境中温浴90 min，移出加400 μl GA Buffer混匀；12 000 r/min离心2 min，将上清液转移到1个新的1.5 ml离心管；加300 μl的G Binding Buffer和50 μl无水乙醇混合均匀；将混合液体分2次转移至Spin column，6 000 r/min离心30 s，弃去接液管内液体；向 Spin column中加入 500 μl的 G Binding Buffer，10 000 r/min离心30 s，弃去接液管内液体；向 Spin column 中 加 入 600 μl的 Wash Buffer，10 000 r/min离心30 s，弃去接液管内液体；重复1次；再次将Spin column10 000 r/min离心1 min，将Spin column转移到1个新的1.5 ml离心管；向Spin column 中加 100 μl至 200 μl Elution Buffer，室温温育 1 min；12 000 r/min离心 1 min，并弃 Spin column；1.5 ml离心管中液体含有DNA。

2.2.3 引物合成设计 引物序列设计如下：APP正义链：5′-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3′，反义链：5′-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC-3′；APP产物大小为344 bp。PS1正义链：5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′，反义链：5′-GCC ATG AGG GCA CTA AT AT-3′；PS1产物大小为608 bp。反应体系20 μl扩增条件为：95℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，59℃退火40 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸 1 min。GAPDH 正义链：5′-AAA TGG TGA AG TCG GTG TGAA C-3′，反义链：5′-CAA CA TCT CCA CTT TGC CAC TG-3′；产物大小为9 bp。反应体系20 μl，扩增条件为：95℃预变性min，94℃变性 30 s，59 ℃退火 40 s，72 ℃延伸min，35个循环，72℃延伸 10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行光密度扫描，用凝胶成像分析系统Quantity one进行观察分析。

3 结果

3.1 小鼠繁殖及分辨年龄 每次生产6～10只，周后小鼠跳笼活跃，平均每笼只能饲养4～5只。小鼠整个身体粉红且腹部无奶时，为前一晚出生或出生当天；小鼠腹部有一小团白色物质，为出生2～d；当小鼠背部长出皮毛时，为出生3～4 d；当小鼠毛长全，但眼睛未睁开时，为出生10 d左右；当小鼠眼睛刚开，耳朵未开时，此小鼠为出生12 d左右；当小鼠耳朵刚开时，为出生14 d左右。2～3周是剪鼠尾基因鉴定的最佳期间。

3.2 APP/PS1双转基因小鼠基因表型的鉴定 以基因组DNA为模板扩增，可见在9只小鼠中均扩增出约100 bp大小条带阳性对照内参基因GAPDH，其中 3 只小鼠（1、2、3）基因组 DNA 扩增出约350 bp及约600 bp大小的条带，与预计所扩增的APP及PS1基因大小一致。鉴定结果见图1。

图1 APP/PS1双转基因小鼠基因表型的鉴定

4 讨论

阿尔海默病可分为家族性（FAD）和散发性或迟发性（SAD/LOAD）。FAD为常染色体显性遗传病，仅占全部AD的15%以下，而LOAD没有明显的遗传背景，目前研究认为发病主要与β淀粉样前体蛋白（APP）基因及早老素蛋白（PS）遗传基因突变有关[5]。中枢神经系统PS主要集中在海马和皮层内。PS是一种跨膜蛋白，可在细胞中与APP形成复合物，参与APP转运及合成后加工。1995年Games等首次报道成功将人突变型淀粉样蛋白前体APP基因转入小鼠后，AD转基因动物模型成为AD研究热点[6]。虽然APP转基因动物出现类似AD患者的大脑改变，但是APP突变转基因模型出现病理学及行为学改变均较晚。PS1基因位于14号染色体上，参与APP转运及合成后的加工。在阿尔海默病中APP突变只占AD患者的1%～3%[7]，PS基因突变的患者则高达40%～50%，70%～80%早发家族AD是由PS1基因突变所致，PS1基因继APP之后重要的AD相关基因[8]。2000年Wengenack等[9]制作了APP／PS1双转基因小鼠，表达人突变的PS基因和APP基因，12周后在转基因鼠皮质和海马发现Aβ沉积，而且Aβ的量多伴有神经元改变和突触丢失及年龄有关的神经行为学功能障碍，标志着AD转基因动物模型研究进入了新的阶段。APP/PS1双转基因小鼠模型因较好地模拟了AD的病理特征和渐进性病程，亦被世界公认为常用的AD疾病模型[10]。

转基因动物模型是当今研究临床疾病的热点模型，本文总结了AD模型APP/PS1基因鼠的繁殖进程和基因鉴定。基因鉴定目前提取鼠尾DNA的方法有很多种，以高盐提取法和酚/氯仿提取法为实验室常用2种方法。其中高盐提取法快捷，但提取到的DNA质量有时不能满足特定品系鉴定的需要，改用酚/氯仿法提取[11]。Biospin组织基因组提取试剂盒采用的是酚/氯仿法提取法。本研究从南京大学模式动物研究所购入了APP/PS1双转基因雄性小鼠2只进行繁殖，由于要求配对雌鼠是同窝阴性野生鼠，根据遗传规律所获后代有1/4的机率为阴性纯合子，所以在下一步实验前必须进行基因检测，以区分AD转基因型和野生型（同窝阴性）小鼠。本研究50只子代小鼠基因组DNA中31只小鼠基因组DNA扩增出300 bp的APP条带和600 bP的PS1条带。证明APP/PS1双转基因AD小鼠的饲养和繁殖获得成功，获得了较多的成功转入APP/PS1基因的纯合子小鼠。因此正确饲养繁殖及利用PCR对AD模型鼠的繁殖小鼠进行基因鉴定是获得APP/PS1双转基因纯合子小鼠的有效途径。本实验成功繁殖及鉴定了APP/PS1双转基因AD小鼠的基因型，为课题组今后开展认知障碍的研究提供了理想的AD动物模型。

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