不同金属离子在胶原蛋白自聚集过程中的影响研究

邢建宇，白波，李宇亮，宋秀玲

(长安大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710054)

胶原蛋白是生物体主要的结构蛋白，在体外，当溶液环境变化时，可溶性胶原蛋白可发生自组装聚集作用，进而成纤维化形成胶原纤维。该功能使得胶原蛋白被广泛的应用于化工、医药材料、食品、饲料等领域。天然的胶原蛋白聚集需要的条件，大概为pH 5.0 ～8.5，离子强度在0.1 ～0.8，温度在15 ～37 ℃［1］。以后的研究表明，pH、温度、离子强度、离子类型、表面活性剂、糖类以及胶原蛋白非螺旋末端的去除，都对胶原纤维的形成有影响。

功能性材料的研制及其相关机理研究一直都是化学化工专业的热门领域，但是纯化学合成的材料不利于细胞的吸附，缺乏内源性信号。生物材料在合成中应用可以有效的模拟生物环境，但是其位点选择性修饰比化学方法要复杂，而且机械强度差。将化学合成材料与生物质材料相结合，可兼容有机化合物分子和生物分子的优点，在应用上更有潜力且应用面更广［2］。在化学合成材料与生物质材料相结合过程中，无机离子及有机分子与胶原蛋白的相互作用无疑起着非常关键的基础作用，对于不同金属离子对于胶原蛋白的影响，不仅可以在结构上阐述两者相互作用的方式及机理，研制出更多类型的功能性新材料，如人工骨的合成［3］、微囊材料的研制［4］等。在应用上还会为以胶原蛋白为原料的吸附材料的广泛应用提供参考，如污染水质中重金属的去除［5］、以金属离子为介导的吸附材料的应用［6］等。本文使用不同浓度金属离子对胶原蛋白的自聚集过程进行了研究，并考察了金属离子存在时pH 对该过程的影响。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

牛筋，购 自 西 安 市;CuSO4、ZnSO4、K2SO4、Fe2(SO4)3、胃蛋白酶均为分析纯。

752 型紫外可见分光光度计;XS-212-201 型生物显微镜。

1.2 实验方法

解冻的牛筋冲洗干净后，用剪刀剪成小块，放入体积为牛筋20 倍的0.1 mol/L NaOH 溶液中。在恒温搅拌器下搅拌4 h 以除去胶原蛋白中的非胶原成分。用清水冲洗牛筋至中性。再将牛筋放入体积为牛筋3 倍的0. 5 mol/L 的醋酸溶液中，以质量比1∶100加入胃蛋白酶，静置后过滤得胶原蛋白溶液备用。

取胶原蛋白溶液20 mL，用浓度为0.5 mol/L NaOH 溶液调节pH 至5。分装到4 支试管中。并分别向试管中加入0.5，1.5，2.5 mmol/L 的金属离子。每隔15 min 用紫外分光光度计测溶液的吸光值。每组实验做3 次，取平均值。取胶原蛋白溶液15 mL，分别以每试管5 mL 的量加入3 支试管，调节其pH 分别为3. 0，5. 0，7. 0，再向每支试管加入1.5 mmol/L的金属离子溶液。每隔15 min 用紫外分光光度计测溶液的吸光值。每组实验做3 次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 金属离子与胶原蛋白的相互作用

在不同的pH 下，金属离子与胶原蛋白的相互作用可能会引起不同的聚集状态。由于金属离子的溶解性受pH 影响，所以在特定的pH 条件下，金属离子溶解性会降低并析出。而胶原蛋白在pH 升高的过程中，也会发生自聚集作用，形成胶原纤维。所以研究不同金属离子与胶原蛋白的相互作用时，在pH 影响下的析出过程，会有以金属离子引起胶原变性产生的沉淀以及金属离子辅助胶原蛋白自聚集产生纤维两种情况。胶原蛋白聚集体示意图，见图1。

图1 胶原蛋白聚集体示意图Fig.1 Picture of collagen aggregates

图1A 中，不含有金属离子的胶原蛋白溶液在合适的pH 环境条件下，不需添加任何试剂，可自发进行侧链的相互作用，进而形成胶原纤维。图1B，不同的金属离子可在不同程度上加快或者抑制这一过程。但是所产生的聚集体主要还是以纤维状为主。图1C 当金属离子含量较高时，pH 引起金属离子溶解性的变化，此时胶原蛋白容易发生变性，形成无规则的卷曲，所形成的沉淀聚集，并非以纤维状存在，而是以粒状沉淀为主。

2.2 不同金属离子对胶原蛋白自聚集过程的影响

胶原蛋白在酸性条件下可溶，其自聚集过程的发生，随着pH 的升高，而速率加快。为了考察金属离子对于这种自聚集析出过程的影响，特选择pH 5.0作为考察金属离子影响的最适pH，胶原蛋白浓度选择1 mg/mL。由于不同阴离子对于胶原蛋白的自聚集作用也有着显著的影响［7］，故所选择的阴离子均为硫酸盐，在同样的阴离子存在状态下，对不同的金属离子的影响进行考察。

Cu2+对胶原蛋白自聚集过程的影响见图2A。当不存在Cu2+时，胶原蛋白会发生缓慢的自聚集作用，而随着Cu2+的加入，自聚集作用迅速提高，且随着Cu2+的增加，自聚集的速度也更快。但是当Cu2+为2.5 mmol/L 时，胶原蛋白溶液的浊度先增加后减小。可能是因为Cu2+与胶原蛋白侧链的相互作用是以螯合形式发生的，该种螯合作用有利于侧链之间的聚集，而当金属离子含量增高时，金属离子正电荷之间的互相排斥，而不利于胶原蛋白的聚集。由图2B 和表1 可知，Zn2+对于胶原蛋白自聚集过程的影响比较小，不含Zn2+时，斜率约为0. 15 ×10－3，随着Zn2+的添加，斜率略有升高，变为0.25 ×10－3。当Zn2+浓度为1. 5 mmol/L 时，斜率降为0.13 ×10－3。当Zn2+浓度为2.5 mmol/L 时，斜率降为0.1 ×10－3。说明在0 ～2.5 mmol/L 的浓度范围内，Zn2+在低浓度时有助于胶原蛋白的自聚集，但是随着浓度的升高，而出现抑制作用。由表1 可知，当硫酸铁的含量为0，0.5，1.5，2.5 mmol/L 时，所对应的胶原自聚集曲线的斜率分别为0. 16 ×10－3，1.27 ×10－3，2.2 ×10－3，3.24 ×10－3。在0 ～2.5 mmol/L 的浓度范围内，呈依次增大的趋势且并没有出现抑制的现象。K+的加入会引起胶原蛋白自聚集速率的降低。由图2D 及表1 可知，在0 ～2.5 mmol/L的浓度范围，K+的存在增加了胶原蛋白分子表面的电荷，增强了其与水分子的相互作用，使胶原蛋白的溶解性增大。

图2 pH 5.0 时不同金属离子对胶原蛋白自聚集过程的影响Fig.2 Effect of different metal ions on self-aggregation processes of collagen with pH 5.0

表1 不同金属离子对于胶原自聚集产生的浊度变化速率的影响Table 1 Effect of different metal ions on turbidity change rate produced by collagen self aggregation

根据柯林斯理论［8］，将离子都近似看作为中心处带有一个点电荷的壳球，当离子半径较小时，周围的水合离子就会与之紧密结合;反之，当离子半径较大时，周围的水合离子与它的结合作用就较弱。Cu2+、Zn2+、Fe3+、K+的离子半径分别为0. 073，0.074，0.055，0.138 nm。其中K+的离子半径大于其他3 个离子，所以K+与胶原分子的相互作用力弱于其他3 个离子。而离子半径最小的Fe3+由于能与周围水合离子紧密结合，所以比Zn2+具有更强的结合能力，在引起胶原蛋白自聚集时作用更加明显。Cu2+和Zn2+具有相同的离子半径，但是Cu2+具有更强的促胶原自聚集作用。这可能与Cu2+在溶液中的存在状态有关，Cu2+在水溶液中实际上是以水合离子［Cu(H2O)4］2+的形式存在的，该种水合状态更加有利于Cu2+吸附到胶原蛋白表面。所以Cu2+在金属离子中与胶原蛋白的结合能力最强，很多胶原蛋白吸附材料的制备都表现出对Cu2+强的吸附能力。

2.3 不同金属离子存在的条件下pH 对胶原自聚集过程的影响

使用浓度较低的胶原蛋白溶液(0.3 mg/mL)，分别选取了pH 3.0，5.0，7.0 作为测试Cu2+、Zn2+、Fe3+的pH 条件，根据不同浓度金属离子对胶原蛋白聚集过程的影响，Cu2+、Zn2+、Fe3+的浓度分别选择为1.5，2.5，1.5 mmol/L，结果见图3。

图3 不同pH 下Cu2+、Zn2+、Fe3+对胶原蛋白聚集过程的影响Fig.3 Effect of Cu2+，Zn2+ and Fe3+ on collagen aggregation process with different pH

由于常温下Cu2+可在pH 5.2 ～6.4 形成沉淀。所以由图3A 可知，不同的pH 条件对于Cu2+促胶原蛋白共聚集的影响并不是很大，Cu2+在pH 为5.0时，对胶原共聚集作用影响最大。相对于Cu2+而言，Zn2+在pH 7.0 左右会形成沉淀，所以Zn2+的溶解性有着更加宽泛的pH 范围。由图3B 可知，pH的改变对于Zn2+促胶原蛋白聚集过程的影响较大，pH 为3.0 时，胶原蛋白的聚集作用并不明显，当pH为5.0 时，在45 ～60 min 有较大的浊度变化，预示着聚集作用的发生。当pH 为7.0 时，胶原蛋白的聚集作用发生的时间被缩短，在30 min 时浊度达到平衡。Fe3+存在的条件下，不同pH 对于胶原蛋白自聚集作用的影响见图3C。当pH 为3.0 和5.0时，胶原蛋白溶液的浊度变化并不大，但是当pH 为7.0 时，浊度发生很大的改变，此时胶原蛋白的聚集，可能不再是金属离子辅助的胶原蛋白有规律的成纤维状态，而是以Fe3+析出为主的相变过程，在此过程中胶原蛋白以无规则状态伴随着Fe3+的析出而析出。由以上不同的金属离子的分析可知，因为pH 对于金属离子的存在状态以及对于胶原蛋白的自聚集作用都有较大的影响，且不同金属离子的溶解性具有不同的pH 范围。所以不同的金属离子在胶原自聚集过程中的影响更加复杂。

3 结论

考察了不同的金属离子对于胶原蛋白自聚集过程的影响，在与胶原蛋白的相互作用方面，基本符合柯林斯理论，大小顺序为Cu2+＞Fe3+＞Zn2+＞K+。另外，对于金属离子存在条件下，pH 对于胶原蛋白自聚集的影响研究发现，Cu2+存在时，pH 的影响并不大，而Zn2+存在时影响较大。Fe3+在辅助胶原成纤维方面影响不大，且溶解性受pH 影响更大。

［1］ Li Y P，Asadi A，Monroe M R，et al.pH effects on collagen fibrillogenesis in vitro:Electrostatic interactions and phosphate binding［J］. Materials Science and Engineering:C，2009，29(5):1643-1649.

［2］ 贺金梅，叶真铭，程玮璐，等. 胶原蛋白的功能化改性研究进展［J］.现代化工，2013，33(6):28-31.

［3］ Jia M F，Hong Y P，Duan S Y，et al.The influence of transition metal ions on collagen mineralization［J］.Materials Science and Engineering:C，2013，33(4):2399-2406.

［4］ Przybyla D E，Rubert Pérez C M，Gleaton J，et al.Hierarchical assembly of collagen peptide triple helices into curved disks and metal ion-promoted hollow spheres［J］.Journal of the American Chemical Society，2013，135(9):3418-3422.

［5］ Pourjavadi A，Salimi H，Amini-Fazl M S，et al. Optimization of synthetic conditions of a novel collagen-based superabsorbent hydrogel by Taguchi method and investigation of its metal ions adsorption［J］. Journal of Applied Polymer Science，2006，102(5):4878-4885.

［6］ 邓慧，廖学品. 胶原纤维负载锆对氟离子和磷酸根的吸附去除［J］.精细化工，2013，30(1):80-84.

［7］ Collins K D. Ions from the Hofmeister series and osmolytes:effects on proteins in solution and in the crystallization process［J］.Methods，2004，34(3):300-311.

［8］ Collins K D，Neilson G W，Enderby J E. Ions in water:Characterizing the forces that control chemical processes and biological structure［J］.Biophysical Chemistry，2007，128(2/3):95-104.