L-茶氨酸生物制备技术和生物功能研究进展

贲培玲，朱岩岩，殷志敏*

（1.滁州城市职业学院，安徽滁州 239000；2.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046）

茶叶被誉为“世界三大饮料之一”，其中含有的儿茶素、胆甾烯酮、咖啡碱、茶氨酸、叶酸、泛酸等成分有益于人体健康。L-茶氨酸，即N-乙基-γ谷氨酰胺（Nethyl-γ-L-glutamine），属酰胺类化合物，是茶叶中含量最丰富的游离氨基酸，是茶叶的主要呈味物质[1]。在新鲜的茶叶中，L-茶氨酸的含量约占干重的1%～2%；在茶汤中，L-茶氨酸的浸出率可高达80%。L-茶氨酸有多种生物学功效，如保护脑神经、抗疲劳、抗肿瘤等，已被广泛研究和关注。

1 L-茶氨酸的理化性质

茶氨酸的分子式为C7H14N2O3，相对分子量为174.20，化学结构式见图1，构型有D型和L型，自然界存在的茶氨酸均为L型。L-茶氨酸纯品为白色针状结晶，极易溶于水，不溶于乙醇或乙醚，水溶液为微酸性，具有焦糖的香味和味精的鲜味。L-茶氨酸的性质比较稳定，熔点为217～218℃，在沸水中煮沸5 min，或将其溶于pH 3.0 的溶液中在25℃下存放12个月，其含量基本保持不变[2]。

图1 L-茶氨酸结构式Fig.1 Chemical structure of L-theanine

2 L-茶氨酸生物制备技术的研究现状

茶氨酸在食品、化工及医药等领域的应用广泛，需求量大。目前生产茶氨酸的方法主要有提取法、植物组织培养法、化学合成法和生物合成法。随着生物技术的发展和应用，利用微生物发酵生产酶，进而利用酶来催化生产L-茶氨酸的技术日益受到重视。用于合成茶氨酸的酶主要有：茶氨酸合成酶、谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和γ-谷氨酰转肽酶。酶催化合成L-茶氨酸的原理有：（1）谷氨酸和乙胺为底物的连接合成反应，反应需要ATP 供能；（2）谷氨酰胺和乙胺为底物的酰基转移反应。酶催化生产L-茶氨酸过程见图2，下面介绍几种用于合成茶氨酸的酶的研究和应用状况。

图2 酶催化生产L-茶氨酸Fig.2 Biotechnological production of L-theanine by enzymes

2.1 茶氨酸合成酶 （Theanine synthetase，TS，EC 6.3.1.6）

茶氨酸合成酶是茶树独有的酶，对谷氨酸、乙胺和ATP 有高亲和力，主要在茶树的根部催化谷氨酸与乙胺生成L-茶氨酸，L-茶氨酸从根部输送到叶中[3]。李平等[4]以茶籽为原料培育茶苗，从茶苗中提取L-茶氨酸合成酶。L-茶氨酸合成酶的最佳反应温度为35℃，作用时间为40 min，pH 为7.5。但是因为该酶不稳定，对其分离纯化条件仍需研究。

2.2 谷氨酰胺合成酶 （L-glutamine synthetase，GS，EC 6.3.1.2）

GS 催化谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸，反应需要ATP。Yamamoto 等[5]将腐臭假单胞菌Y-30 的GS 基因克隆转化入大肠杆菌E.coli AD494（DE3）/pET21a-GS 细胞中，GS 能伴随发酵能量的转移催化合成L-茶氨酸。朱文娴等[6]将荧光假单胞菌GS 基因转接入pET32a 质粒中，再将重组质粒转化到E.coli BL21 中，构建合成L-茶氨酸的基因工程菌。工程菌株经0.1 mmol/L IPTG，28℃诱导表达，湿菌体的酶活力达到41.79 U/mg prot。工程菌催化L-谷氨酸钠和盐酸乙胺反应生成L-茶氨酸的产量达6.2 g/L。

2.3 γ-谷氨酰甲胺合成酶（γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS，EC 6.3.4.12）

Kimura 等[7]从噬甲基菌AA-30 中纯化出GMAS，该酶在pH 值7.5 和40℃条件下有最大活性，可将底物L-谷氨酸和乙胺催化合成L-茶氨酸。而从 E.coli AD494（DE3）/pET21a-GM 提取 GMAS，催化谷氨酸和乙胺的反应需与糖酵解耦合，即需利用酵母提供ATP 再生系统，并需要Mg2+和Mn2+的参与。增加GMAS 和底物浓度，能增加L-茶氨酸产量。但是高浓度的乙胺（900 mM 或更多）抑制酵母系统糖酵解导致L-茶氨酸产量降低[8]。

2.4 谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS，EC 3.5.1.2）

GLS 在碱性条件下催化L-谷氨酰胺水解为L-谷氨酸和NH3，将谷氨酰胺基团转移至乙胺，合成L-茶氨酸，且不需要供能。本实验室研究了优化重组谷氨酰胺酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的反应条件。从假单胞菌DSM14399 中获得GLS 基因（PnGLS）为909 bps，编码302个氨基酸蛋白质，含有GLSs 关键的催化基团（Ser61，Lys64，Asn111，Lys193 和 Ser194）。生产 L-茶氨酸的最佳条件是0.3M 谷氨酰胺，1.5M 乙胺和1.5U/5mL重组PnGLS，pH 10.0（100 mM 硼酸盐缓冲液），37℃反应5 h，纸层析和HPLC 检测L-茶氨酸产量21.8 g/L[9]。

2.5 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS，EC 6.3.2.2）

γ-GCS 是谷胱甘肽合成关键酶，能将L-谷氨酸和L-半胱氨酸为底物催化合成γ-谷氨酰半胱氨酸，还能催化L-谷氨酸和胺生成γ-谷氨酰胺衍生物。Miyake 等[10]将重组质粒E.coli DH5α/pGSK1 表达的γ-GCS，并利用葡萄糖糖酵解产生的ATP，在反应18 h后能以429 mM 乙胺合成12.1 mM L-茶氨酸。

2.6 γ-谷氨酰转肽酶（glutamyltranspeptidase，γ-GGT，EC 2.3.2.2）

γ-GGT 在哺乳动物组织谷胱甘肽代谢中发挥关键作用，也是催化转移L-γ-谷氨酰基的特异酶。细菌的GGT 在胞质或胞外是可溶的非糖基化蛋白，并且有更广泛的底物，有利于生物技术应用。Suzuki 等[11]首次报道用E.coil K-12 的GGT催化-γ-谷氨酰基与乙胺生成L-茶氨酸。本实验室从E.coil K-12 中克隆出γ-GGT 转入原核表达载体pET28a 中，从而构建了在E.coli BL21（DE3）菌株高效表达γ-GTT 的工程菌，该菌经0.2 mM IPTG、20℃诱导表达8 h，粗酶液的酶活力1.5 U/mL，约是出发菌株E.coil K-12 的26倍。在37℃、pH 10.0条件下，工程菌粗酶液催化267 mM 谷氨酰胺和2.0 M 乙胺生成L-茶氨酸26.9 g/L，谷氨酰胺的转化率为57.8%[12]。运用小泛素相关修饰（SUMO）融合技术在E.coli K-12 中表达及纯化重组蛋白GGT，用M9（由甘油和无机盐）和0.1%（重量/体积）的乳糖分别作为培养基和诱导剂，在1 L 的发酵液中能获得纯度不低于95%的GGT。1500 U 的纯化重组GGT 在1 L 的反应体系中合成41 g L-茶氨酸[13]。Bindal 等[14]用地衣芽孢杆菌ER-15 重组表达GGT，反应体系为50 mM Tris-Cl 缓冲液中（pH 9.0）含 80 mM L-谷氨酰胺、600 mM 乙胺和1.0 U/mL GGT，在37℃下85%～87%L-谷氨酰胺可以转换成L-茶氨酸。利用碳酸钙固定化GGT，1 L 反应体系中可获得35.2 g L-茶氨酸。将枯草芽孢杆菌168 GGT 基因克隆到大肠杆菌BL21（DE3）中可分泌表达γ-GGT。γ-GGT 的催化活性的最佳pH 值为10.0，在37℃下，γ-GGT 催化200 mM 的L-谷氨酰胺和2.2 M 乙胺生产L-茶氨酸，转换率78%，而在底物为500 mM L-谷氨酰胺和1 M 乙胺时，转换率下降至58%和45%，该研究为高底物浓度的L-茶氨酸的工业化生产提供依据[15]。

3 L-茶氨酸的生物学功能研究

L-茶氨酸经口被动物摄入后在小肠粘膜刷状缘以钠离子依赖的转运体转运入血，并可以通过亮氨酸转运系统透过血脑屏障进入脑部。采用灌胃的方法使大鼠服用200 mg/kg L-茶氨酸后，血清中L-茶氨酸峰值出现在0.5～1.0 h 之间，脑组织中L-茶氨酸浓度5 h 达到峰值，24 h后这些组织中的L-茶氨酸完全消失。L-茶氨酸在体内的分解代谢主要在肾脏中进行，L-茶氨酸在肾脏中被谷氨酰胺酶所催化降解成谷氨酸和乙胺[16]。

3.1 神经保护作用

L-茶氨酸在短暂性脑缺血动物模型上显示出具有脑神经保护作用。将沙鼠双侧颈动脉闭塞3 min后可诱导短暂性前脑缺血。脑缺血7 d后，海马CA1 区锥体神经元退化或消失。在缺血30 min前给1 μL 的500 μM L-茶氨酸，海马CA1 区锥体神经元保持良好。L-茶氨酸预处理显著抑制神经元缺血，抑制海马区CA1 区细胞死亡[17]。L-茶氨酸通过抑制缺血神经细胞死亡减少认知功能障碍，可以预防脑血管病。

Zukhurova 等[18]研究利用大鼠脑缺血再灌注模型探讨L-茶氨酸对脑损伤的影响，他们将大鼠进行30 min 的大脑中动脉闭塞，随后进行48 h 的再灌注，再灌注结束后检测神经的缺损及脑梗死面积。研究结果显示，在大鼠脑缺血再灌注后3 h和12 h 给予L-茶氨酸（1 mg/kg 和4 mg/kg）能显著缩小脑梗塞面积。再灌注后3 h、12 h 和24 h 给予L-茶氨酸可使神经系统状态得到改善。再灌注期间在纹状体内重复注射L-茶氨酸使总量达800 μg/kg 能显著阻止谷氨酸受体激动剂介导的脑损伤。该研究说明L-茶氨酸在大鼠脑卒中模型中具有神经保护作用。

鱼藤酮和氧桥氯甲桥萘是帕金森症 （PD）相关的神经毒性物质，L-茶氨酸（500 μM）抑制鱼藤酮和氧桥氯甲桥萘诱导的神经母细胞瘤 （SHSY5Y）细胞DNA 断裂和细胞凋亡、部分阻止鱼藤酮和氧桥氯甲桥萘诱导血红素氧合酶-1（HO-1）上调；L-茶氨酸预处理明显阻断鱼藤酮和氧桥氯甲桥萘诱导细胞外信号调节激酶2（ERK1/2）磷酸化下调、显著抑制SH-SY5Y 细胞中脑源性神经营养因子 （BDNF）与胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达的下调。这些结果表明，L-茶氨酸直接提供神经保护作用抵御PD 相关的神经毒性刺激，有可能用于临床治疗PD[19]。

3-硝基丙酸（3-NP）能诱导大鼠亨廷顿舞蹈病（HD）样症状，大鼠每天口服L-茶氨酸（100 mg/kg或 200 mg/kg），1 h 后腹腔注射 3-NP （1 mg/kg），共进行14 d。实验显示，L-茶氨酸显著抑制3-NP诱导的大鼠行为学的改变和氧化应激，恢复3-NP减弱的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化物酶（CAT）和琥珀脱氢酸（SDH）的活性，减少3-NP 诱导的纹状体神经元损伤[20]。

L-茶氨酸亦能抑制镉诱导的细胞凋亡。L-茶氨酸可抑制镉诱导的PI3K/Akt 磷酸化以及ERK1/2 和JNK 信号通路的激活，并降低镉诱导的ROS 产生和线粒体跨膜电位的中断，从而降低Bax/Bcl-2 比值，抑制caspase-9 和caspase-3 激活以及PARP 切割[21]。

3.2 改善记忆和认知功能障碍

茶氨酸影响神经传递，尤其是抑制性突触传递。孕鼠自由采食茶氨酸。幼年大鼠的体重增长率与对照组无差异。测定幼年大鼠血清中神经递质浓度如多巴胺，5-羟色胺，GABA 和甘氨酸，茶氨酸组浓度比对照组高；幼年大鼠大脑皮层和海马和脑神经生长因子（NGF）在mRNA 水平增加。然而，这些差异在神经成熟期结束时丢失。结果表明，茶氨酸能增强神经生长因子和神经递质的合成和促进中枢神经系统（CNS）成熟[22]。 Takeda[23]等给新生大鼠喂食0.3%的L-茶氨酸水溶液，随后的6周内均保持脑内L-茶氨酸可测出。他们发现茶氨酸不影响大鼠在开场中的自发行为，但可增加动物站立的探究行为，并能增强大鼠的目标识别记忆（Object recognition memory）。 此外，茶氨酸促进大鼠脑中海马颗粒细胞的生长，提示其促进海马的发育。给断奶后的幼年大鼠喂食0.3%的L-茶氨酸水溶液3个月，应激引起的大鼠认知功能障碍和海马长时程增强（LTP）的损害显著被抑制，这种抑制作用可能与茶氨酸调控糖皮质激素分泌相关[24]。

淀粉样蛋白β（Aβ）诱导的神经毒性是阿尔茨海默病（AD）主要的病理机制。给小鼠口服L-茶氨酸 2 和 4 mg/kg，持续 5周，再侧脑注射 Aβ1-42（2 μg/鼠），L-茶氨酸能显著抑制 Aβ1-42引起的记忆障碍。此外，L-茶氨酸减少Aβ1-42诱导的大脑皮质和海马区神经细胞死亡，显著减少脑内脂质氧化和提高GSH 水平，提示氨酸可以预防和治疗AD[25]。

3.3 抗抑郁

利用小鼠强迫游泳试、悬尾、开场和利血平实验，研究人员发现L-茶氨酸具有抗抑郁活性，并可能与其调节中枢系统单胺神经递质相关[26]。L-茶氨酸和氟西汀相同，可以有效改善抑郁模型大鼠的抑郁行为，并提高前额皮层、伏隔核、海马区、脑干等脑区单胺神经递质如去甲肾上腺素（NE）、5-HT、DA 及部分代谢产物的浓度，降低谷氨酸及其前体谷氨酰胺的浓度，说明L-茶氨酸的抗抑郁机制可能和氟西汀类似，即抑制神经元对5-HT的重摄取以增加细胞外可以和突触后受体结合的5-HT 水平[27]。

3.4 镇静、抗焦虑

给大鼠注射0.970 mg/kg 以上的咖啡碱后，大鼠大脑的β波增强，δ波减弱，α和θ波无变化，说明其处于兴奋状态。咖啡碱的兴奋作用持续180 min 以上。如果在给大鼠注射咖啡碱后10 min再给其注射0.781 mg/kg L-茶氨酸，15 min后检测出大鼠大脑中的β波减弱，δ波增强。表明L-茶氨酸抑制了咖啡碱引起的兴奋作用[28]。

L-茶氨酸能显著抑制阿片戒断症状，包括好斗、腹肌僵硬、腹部扪诊发声、踱步、干呕、落水狗样动作、自慰等。L-茶氨酸能快速起效，持续2.5 h。高架十字迷宫和埋珠实验结果表明L-茶氨酸能减少小鼠焦虑样行为但并不影响其运动行为。说明L-茶氨酸可在阿片类戒断以及焦虑相关行为的药物治疗方面发挥作用[29]。

3.5 肝脏保护作用

本实验室的研究表明L-茶氨酸能抑制H2O2引起的肝细胞L02 存活率降低，并通过抑制Caspase-3 激活和PARP 切割及Bax/Bcl-2 比值的升高发挥抗凋亡作用[30]。L-茶氨酸在体内外均能保护动物抵御乙醇诱导的肝细胞损伤，降低乙醇对肝细胞的毒性作用，抑制乙醇诱导的肝细胞凋亡，减少乙醇引起的氧自由基和丙二醛（MDA）的含量，增加还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，恢复肝细胞的抗氧化损伤的能力[31]。在小鼠体内，乙醇能够诱导丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和MDA 的含量升高，L-茶氨酸能逆转这种升高作用。雄性ICR 小鼠每天喂食50、100、200 mg/kg L-茶氨酸7天后，用四氯化碳（CCl4）处理小鼠，发现L-茶氨酸能剂量依赖性地抑制CCl4引起的ALT 和AST 的升高，减少CCl4 引起的脂质过氧化，增加肝脏内还原型谷胱甘肽的含量和抗氧化酶的活性。L-茶氨酸还能通过下调细胞色素P4502 E1 的含量，抑制CCl4 的代谢活化。L-茶氨酸能抑制CCl4诱导的血浆中炎症介质TNF-α和IL-1β增加，减少肝脏环氧化酶2（Cycloxygenase，COX-2）和诱导型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase， iNOS）表达减少，抑制四氯化碳引起的肝细胞凋亡[32]。

3.6 抗肿瘤作用

在体外实验中，茶氨酸抑制人非小细胞肺癌A549 和白血病K562 细胞的生长是呈时间和剂量的依赖性。此外，茶氨酸对A549 细胞迁移的抑制作用。更重要的是，茶氨酸增强抗癌活性的抗癌药物如曲古抑菌素A（组蛋白去乙酰化酶抑制剂）、小檗胺和去甲斑蝥素。抑制A549 细胞迁移的可能是茶氨酸对抗A549 细胞侵袭作用的重要机制[33]。合成的L-茶氨酸衍生物抑制肺肿瘤细胞和白血病细胞的迁移生长，诱导的肺癌细胞凋亡以及抑制肺癌细胞的生长[34]。

L-茶氨酸可以通过抑制谷氨酸转运体抑制化疗药物阿霉素从埃利希腹水癌细胞中流出，从而提高阿霉素的抗肿瘤效应[35]。同样，L-茶氨酸能增强其他蒽环类药物顺铂、伊立替康抗肿瘤活性。L-茶氨酸还可以防止阿霉素诱导的急性肝损伤。因此，L-茶氨酸对抗肿瘤药物疗效的调节作用使其有望在临床肿瘤化疗中使用。

3.7 降血压作用

Yokogoshi 等[36]给原发性高血压大鼠（SHR）和正常的Wistar 大鼠（WKY）腹腔注射同剂量L-茶氨酸（0、500、1000、2000 mg/kg）。高剂量 L-茶氨酸（1000、2000 mg/kg）显著降低 SHR 大鼠血压。2000 mg/kg L-茶氨酸没有改变正常大鼠血压。L-茶氨酸处理的SHR 大鼠和WKY 大鼠的大脑中5-羟色胺显著降低，呈剂量依赖性。Rogers 等[37]的研究显示L-茶氨酸能降低人体血压，拮抗咖啡因刺激引起的血压升高。

3.8 增强人体免疫力作用

Kuriharai 等[38]的研究显示，小鼠同时服用L-茶氨酸和L-半胱氨酸能提高GSH 水平，增高血清中IL-10/IFN-γ的比率，增加血清中特异抗原的IgG，促进Th2 细胞介导的免疫反应。小鼠同时服用L-茶氨酸和L-半胱氨酸能抑制肠道血液中IL-6 升高和GSH 降低。行为学分析显示L-茶氨酸和L-半胱氨酸同时服用能促进术后行为活动和恢复进食。老年患者血清总蛋白低或血红蛋白低，在接种疫苗前，服用L-茶氨酸和半胱氨酸，可加强机体对流感疫苗的免疫原性[39]。

L-茶氨酸有以上多方面的生理功能，不仅在药用方面有很好的价值，在食品领域也有很好的利用前景。因为L-茶氨酸用于食品和保健品，对于食品级的酶的筛选和研究仍需深入。定点突变修饰或定向分子进化能提高工业用酶的活性和性能。未来L-茶氨酸高水平生产仍需要提高转化率，降低生产成本以及改进下游生产工艺。对于L-茶氨酸的生理药理功能也需进一步深入研究，以便更好地开发和利用L-茶氨酸。

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