复合益生菌与金霉素配合抑制大肠杆菌生长的研究

朱 群，王二柱，常 娟，尹清强(河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002)

抗生素对特异性的微生物具有抑制或杀灭作用［1］，作为一种抗菌消炎药，在过去的几十年内在治疗和预防动物疾病上给人们带来了很多的益处，但同时也带来许多负面影响。因为它在杀死致病菌的同时，对有益菌也有一定的杀灭作用，随着抗药和耐药菌及“超级病菌”的出现，人们加大了抗生素的用量，导致药物残留等畜产品安全问题日益严重，给人们的健康带来了不良影响，寻找抗生素替代品成为当今研究的热点问题。

益生菌是一种活菌制剂，其本身及其代谢产物对动物机体能够发挥有益的作用［2］，作为一种新的饲料添加剂逐渐为人们所熟知。益生菌能够在数量上和种类上补充肠道内缺乏的微生物菌群，当其在动物肠道内达到一定数量时能调整并维持肠道内正常的微生态平衡，抑制有害微生物的生长［3］，益生菌的体外抑菌试验可以采用牛津杯法测定［4］。益生菌的抑菌能力归因于其种群优势、竞争性抑制及其代谢产物(如乳酸等)。有些益生菌(如芽孢杆菌)虽然不能在动物体内长期定植，但是当其经过肠道时利用种群优势发挥生物夺氧的功能，从而抑制其他需氧菌的生长，同时还能产生多种维生素等营养物质供动物体吸收利用［5］。基于益生菌的独特优势，它逐渐在动物生产中得以广泛应用［6－7］。

金霉素(Chlortetracycline)，又名氯四环素，属于广谱抗生素，许多立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体对金霉素敏感。随着人们对畜产品安全生产重视度的不断提高，抗生素的禁止和限制使用越来越普遍。尽管抗生素对致病菌和益生菌都具有杀灭作用，但有研究表明抗生素与益生菌的联合使用也能达到很好的效果［8－9］。为了探讨金霉素和益生菌联合抑制致病菌生长的效果，使金霉素在低剂量的情况下发挥最大的抑菌和促生产作用，笔者选用乳酪杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母4种益生菌和金霉素配比研究其对致病菌性大肠杆菌的抑制作用，探讨金霉素与微生态制剂的最佳配伍比例，为益生菌和抗生素的配伍使用提供理论依据，以期获得一种新型的饲料添加剂或高效的治疗动物消化道疾病的复合药物制剂。

1 材料与方法

1.1 金霉素与微生物 金霉素由河南驻马店华中正大有限公司提供，其标准溶液的配制为:样品置于干燥器中干燥12 h后，准确称取3 g样品(精确到0.000 2 g)加0.1 mol/L盐酸30 ml搅拌5 h后定容至50 ml，在无菌条件下用0.2 μm滤膜过滤，配置成9 000 U/ml的无菌金霉素溶液，然后通过不同梯度的稀释，制备金霉素含量分别为75、150、200、300、400、500和600 mg/L的标准溶液。益生菌:枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母、乳酪杆菌、粪肠球菌和大肠杆菌均由河南农业大学动物营养与生物技术实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1 培养大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的LB培养基。胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、用蒸馏水定容至1 L，pH 为7.0 ～7.2，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌 20 min。接种大肠杆菌后，37℃振荡(150 r/min)培养48 h。

1.2.2 大肠杆菌鉴别培养基－伊红美蓝培养基。蛋白胨10 g、乳糖 10 g、磷酸氢二钾 2 g、琼脂 14 g、伊红 0.4 g、美兰0.065 g，定容至1 L，pH 为7.2 ±0.4，在 0.15 MPa 高压下蒸汽灭菌20 min。平皿接种微生物后在37℃培养48 h，然后记录大肠杆菌的菌落数(具有金属光泽的菌落)，以对数(lg)形式表示。

1.2.3 培养乳酸杆菌和粪肠球菌的MRS培养基。胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐温(80)1 ml、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸钠 2 g、硫酸镁200 mg、硫酸锰50 mg，用蒸馏水定容至1 L，pH 为6.2 ～6.6，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌20 min。接种乳酸杆菌后，37℃下静止培养48 h。

1.2.4 培养酵母菌的YPD培养基。酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 L，pH 为7.0 ～7.2，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌20 min。接种酵母菌后，30℃下振荡(150 r/min)培养48 h。

1.3 试验方法

1.3.1 复合益生菌对大肠杆菌的抑菌作用。按照4因素4水平的正交试验设计，先将单独益生菌培养液用培养基稀释至活菌数为1×108个/ml，然后按4因素4水平表配制成复合益生菌制剂。将大肠杆菌的培养液均匀的涂布在已加入固体培养基的平皿中，待其完全吸收后放入牛津杯，向牛津杯中加入100 μl复合益生菌菌液，每个处理3个重复，放于4℃条件下吸收4 h，然后于37℃恒温培养箱中培养24 h，测定抑菌圈直径。

1.3.2 复合益生菌与金霉素配伍对大肠杆菌的抑菌效果。按照“1.3.1”选出的复合益生菌最优组合，加入一定量的金霉素，配制成含不同金霉素浓度的复合益生菌制剂。另外，以不同浓度的单一金霉素作为对照组，按照“1.3.1”中方法测定抑菌圈大小。

1.4 数据统计与分析 试验数据用平均值±标准差表示，使用SAS 6.12统计软件对试验数据进行显著性检验，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对大肠杆菌生长的抑制作用 从表1可以看出，复合益生菌抑制大肠杆菌的最佳组合为枯草芽孢杆菌∶酵母菌∶乳酪杆菌∶粪肠球菌 =2∶1∶3∶4(P ＜0.05)。

2.2 复合益生菌与金霉素配伍对大肠杆菌生长的抑制作用 由表2可知，随着金霉素浓度的提高，无论是单一的金霉素还是其与益生菌的复合物，其抑菌作用逐渐增强(P＜0.05)。单独复合益生菌对大肠杆菌的抑制作用与75～150 mg/L的金霉素相当。当150 mg/L金霉素与益生菌配合后，其抑菌效果与单独300～400 mg/L金霉素作用相当;而当400 mg/L金霉素与益生菌配合后，其抑菌效果要优于单独600 mg/L金霉素的作用。由此可知，低浓度金霉素与复合益生菌配合后，可以达到高浓度金霉素的抑菌效果。

3 讨论与结论

3.1 单独复合益生菌对大肠杆菌的抑制作用 益生菌作为动物体内的一部分与机体的健康密切相关，其中一个很重要的作用就是抑制病原微生物的生长，维持肠道微生物区系平衡［10］。该研究结果表明，各种益生菌添加比例不同，其对大肠杆菌的抑制作用也不同，说明4种益生菌分别抑制大肠杆菌的能力有一定的差异，并存在一定的协同性。据报道，芽孢杆菌和乳酸菌之间利用生物夺氧和改变环境的酸碱度的方式进行协同抗菌［11－12］，与该研究结果相一致。

表1 复合益生菌组合对大肠杆菌的抑制效果

表2 复合益生菌与金霉素配伍对大肠杆菌的抑菌圈直径

3.2 复合益生菌与金霉素联合对大肠杆菌的抑制作用 该试验所用的金霉素作为一种广谱抗菌药，对很多细菌都有抑制作用。但是，有研究表明有些益生菌的基因组内存在抗性基因，对抗生素有一定的耐药性［13－14］，这就为益生菌与抗生素的联合使用提供了依据。该研究结果表明单独益生菌对大肠杆菌的抑制作用要高于益生菌和75 mg/L的金霉素联合作用的效果，并且当金霉素浓度高于75 mg/L时，联合作用的效果都要高于单独金霉素和单独益生菌的作用。这说明复合益生菌对金霉素有一定的抵抗能力，同时也能与抗生素协同抑制大肠杆菌的生长。马艳等［15］研究结果也表明益生菌可以与一些抗生素的联合使用，并且益生菌的复合应用还可以降低单株菌对某些抗生素的敏感性，从而扩大了益生菌与抗生素配伍使用的范围。

笔者通过益生菌和抗生素单独及联合使用，可以看出单独益生菌对大肠杆菌生长的抑制作用与75～150 mg/L金霉素相当，说明复合益生菌具有低浓度金霉素的作用效果，而且联合使用的效果要比单独使用金霉素效果要好。在实际应用中，借助益生菌的联合应用可以实现低剂量金霉素的添加，达到高剂量金霉素的效果。这对于减少抗药和耐药菌的产生、减少药物残留、维持机体微生态平衡及提高畜产品的安全性具有重要意义。

该试验结果表明，当复合益生菌与金霉素联合使用时，其抑菌效果要优于单独使用金霉素或益生菌。同时，可以使低剂量金霉素达到高剂量金霉素的抑菌效果，对于减少超级病原菌的产生及提高畜产品品质具有重要意义重大。

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