藕的组织切片制作方法及显微结构研究

徐国鑫　李效尊　刘蓬　尹静静　吴修

摘要：通过组织切片制片和染色方法改进，建立了能够清晰显示藕的组织和细胞结构的技术体系，并在此基础上分析了淀粉粒、维管束和分泌细胞的分布规律。

关键词：藕；组织切片；显微结构

中图分类号：S645.101

文献标识号：A

文章编号：1001-4942（2015）10-0029-04

莲是睡莲科多年生水生草本植物，藕是其膨大的根状茎，藕营养成分丰富，是我国优良的特色蔬菜和副食佳品。藕的地方品种数量繁多，品质各有特色。随着我国人民生活水平的改善，消费者对藕品质的要求日益提高，其品质性状成为莲藕育种和食品领域专家关注的重点。

以往对于藕品质的研究，主要从测定其所含糖类、淀粉、纤维素等成分入手，而针对其细胞形态和内含物质分布规律的研究比较缺乏。石蜡切片技术被广泛应用于植物组织结构研究，但是对于不同特性的植物样品，需要对制片和染色方法进行改进。目前尚未见藕石蜡切片制作技术相关研究的报道。

本实验室前期研究发现，莲藕细胞内含有大量淀粉粒，使用蕃红、固绿和甲苯胺蓝等传统染色方法对藕的石蜡切片进行染色，效果不够理想。为此笔者经过多次试验探索出PAS反应-甲苯胺蓝双重染色的方法，它能清晰显示出藕的细胞壁、维管束和淀粉粒等结构，从而可增进对莲藕组织结构的了解，也为进一步研究其发育过程和贮藏物质积累规律提供必要技术手段。

1材料与方法

1.1试验材料

莲藕杂交品系由山东省农业科学院水生生物研究中心培育，种植于该院饮马泉试验基地。2014年12月设三个取样点挖取其膨大的地下茎，选其节段中部为供试材料。

1.2试验方法

1.2.1所需试剂 ①FAA固定液：50%乙醇：福尔马林：冰醋酸=90：5：5。②席夫（Sehiff）试剂：称取碱性品红0.5g，加入蒸馏水100mL，沸水浴加热溶解5min，冷却至室温后经滤纸过滤，加入偏亚硫酸氢钠1g和浓盐酸2mL，充分混匀后避光密封保存，约24h后试剂变成浅黄色即可使用。③改良甲苯胺蓝染色液：称取甲苯胺蓝0.5g，加入30%乙醇100mL，加热至65℃，搅拌30min，过滤后避光保存。

1.2.2制片 石蜡切片方法参照田晨霞等的方法并进行改进，具体步骤为：

①固定：将莲藕茎段中部切成厚度2mm的薄片，浸入FAA固定液中，用真空泵抽气20min，固定12h以上。

②脱水：依次通过质量分数为50%、75%、95%、100%梯度乙醇溶液，100%乙醇溶液需更换3次，每次2h。依次通过体积比为50%、75%、100%梯度乙醇/二甲苯溶液，100%二甲苯溶液需更换3次，每次2h。

③浸蜡：将样品浸入50%石蜡/二甲苯溶液中，置于60℃烘箱，6h后将50%石蜡/二甲苯溶液吸出，换全蜡3次，每次6h。将样品倒入包埋模具中，冷却至室温。

④切片：在转轮式切片机上切成厚度为10μm切片，置于载玻片上，40℃展片；载玻片上的水分彻底蒸发后，用二甲苯脱蜡、无水乙醇浸洗。

⑤复水：依次通过质量分数为100%、95%、75%、50%和30%梯度乙醇溶液。

1.2.3染色 以传统的甲苯胺蓝染色法作为对照，使用PAS-甲苯胺蓝染色法对藕石蜡切片进行染色，具体步骤如下：

①PAS染色：参考Bronner的方法，并进行改进。将粘附有切片的载玻片浸入0.4%（W/W）的高碘酸钾溶液中处理20min，自来水冲洗，蒸馏水浸洗3次，每次2min；浸入Sehiff试剂中染色20min，自来水冲洗，蒸馏水浸洗2次，每次1min。

②甲苯胺蓝染色：将载玻片浸入改良甲苯胺蓝染色液中，染色10min，自来水冲洗，蒸馏水浸洗2次，每次1min，35℃烘干。中性树胶封片，镜检拍照。

2结果与分析

2.1染色效果比较

在显微镜下观察传统甲苯胺蓝染色法染色后的藕石蜡切片（图1），可以看到，甲苯胺蓝对不同成分的着色特异性较差，只能将淀粉粒和薄壁细胞染为淡蓝色（图1A），并且对表皮细胞着色过深（图1B），无法看清细胞内含物质情况。

使用PAS-甲苯胺蓝双重染色法获得的切片，细胞形态饱满，细胞壁被染为蓝色，细胞内的淀粉粒被染为紫红色，维管束、气腔和分泌细胞等结构清晰（图2B）。本方法不但能够区分不同组织和结构的分布情况，而且染色效果稳定，经封片后可以保存数月而不褪色。

2.2藕组织结构观察

以最外层的细胞为第1层细胞，依次向内统计细胞层数。藕的表皮共有2层细胞构成，其细胞壁较厚，细胞内不含淀粉粒；其中第1层细胞的内含物较少，第2层细胞被黑褐色物质充满，可能是由酚类物质在制片过程中受到氧化形成的（图2B）。从第3层细胞开始呈现薄壁细胞形态，细胞体积和内部淀粉粒的体积逐层增大（图3、图4），至第6层细胞之后，细胞呈相间排列，分层不明显。薄壁细胞之间散在分布有维管束，靠近表皮的维管束较细（图2C）；靠近内侧的维管束较粗，有2～3层维管束鞘细胞包围，内部含有气腔（图2D）。

此外，在薄壁细胞之间分布有少量的分泌细胞（图2B、图2D），分泌细胞内部的物质在切片制作过程中氧化成黑褐色的颗粒，推测这些物质中含有较多的酚类，可能与藕食品加工过程中的褐化现象有关。

3讨论与结论

本研究改进组织切片染色方法后，能清晰显示出藕的组织和细胞结构。传统的石蜡切片染色方法，使用蕃红、固绿和苏木精等染料，若染色条件控制不当会导致染色不足和染色过度。本研究改为双重染色法，首先使用PAS反应将淀粉染成鲜红色，再用甲苯胺蓝将细胞壁染为蓝色（淀粉粒也轻微着色而变成紫红色），染色效果清晰稳定（图2）。

淀粉的含量和性质与藕的品质密切相关。本试验建立的组织制片技术体系能够清晰地显示淀粉粒的分布，对研究莲藕淀粉的积累规律和评价莲藕种质资源均有重要意义。本试验发现藕表皮细胞和分泌细胞中含有的物质氧化后变为黑褐色，这些物质可能与藕烹饪过程中的褐化现象有关，需要进一步探明褐化物质的成分和积累规律。本研究成果为在细胞生物学水平上研究莲藕品质性状奠定了基础，我们将结合其它技术手段解析影响莲藕品质的构成因素，推动莲藕品质育种进步。endprint