藜麦种子总黄酮提取及其抗氧化性

孙雪婷　袁俊杰　蒋玉蓉　陆国权　毛前

摘要：为研究藜麦种子总黄酮的最佳提取工艺以及体外抗氧化活性，采用4因素3水平的正交试验法，探讨乙醇体积分数、料液比、浸提温度和时间等因素对藜麦种子总黄酮的热回流提取的影响。结果表明，藜麦种子总黄酮最佳提取条件为：体积分数80%乙醇，料液比1 g ∶ 30 mL，60 ℃水浴条件下浸提60 min，其黄酮得率为2.64 mg/g。各因素对总黄酮提取率的影响程度从大到小依次为物料比>浸提时间>乙醇体积分数>浸提温度。抗氧化活性试验结果表明，藜麦种子中提取的总黄酮对DPPH·、·OH的清除率分别达90.89%、44.90%，其IC50（半抑制浓度）分别为9996、56.639 μg/mL。

关键词：藜麦；种子；总黄酮；提取工艺；正交试验；抗氧化活性

中图分类号： R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0355-04

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）别称南美藜、奎藜、藜谷、奎奴亚藜等，是一年生的藜科（Chenopodiaceae）草本作物，原产于南美洲安第斯山区，至今已有5 000～7 000多年的利用和种植历史，被印加人称为“谷物之母”和“安第山的真金”[1-2]。藜麦蛋白质含量高达13%～23%，富含人体无法生产和必需的9种氨基酸且比例平衡[3-4]；钙、铁、锌、铜、锰、镁、钾、硒等矿物质营养成分的含量均较高[2，5]；藜麦种子中的油脂富含不饱和脂肪酸、类黄酮、B族维生素和维生素E等多种有益化合物。联合国粮农组织认为，藜麦是唯一的单一植株即可满足人体基本营养需求的食物，是最适合人类的全营养食品[6]。美国国家航空航天局（NASA）更是将藜麦列为人类未来移民外太空空间的理想的“太空粮食”[7]。

总黄酮是植物中重要的次生代谢产物之一，是一种生理活性活泼的物质，具有抗病毒、抗炎、抗癌防癌、防止动脉粥样硬化、降血压、降血脂及胆固醇、抗氧化、防衰老等药理作用[8]。研究者已用不同方法在甘薯（Ipomoea batatas）[9]、荞麦（Fagopyrum esculentum）[10]、银杏（Ginkgo biloba）[11]、枸杞（Lycium chinense Miller）[12]、菊花（Dendranthema morifolium）[13]、柑橘（Citrus reticulata Banco）皮[14]、花生（Arachis hypogaea）壳[15]以及豆科（Leguminosae）植物[16]等中进行总黄酮的提取及其含量测定。然而，有关藜麦总黄酮含量的研究国内外报道甚少[17]。本研究挑选已本土化栽培3年、农艺性状较好的藜麦品种Vanilla为材料，采用正交试验法对藜麦种子总黄酮的乙醇浸提法进行优化，同时测定其抗氧化活性，为优质高总黄酮得率藜麦品种的选育和利用等相关领域的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为农艺性状较好的藜麦品种Vanilla，由浙江农林大学农学院提供，大田种植于该校官塘农场，于2014年4月移载种植，8月下旬收获种子。种子干燥后充分碾碎，过60目筛筛选，装入干燥器皿中备用。

1.2 主要试剂和仪器

试验试剂：DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）购自东京化成工业株式会社；芸香苷对照购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、硫酸亚铁、硝酸铝、过氧化氢、氢氧化钠、水杨酸、亚硝酸钠等试剂（均为国产分析纯）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要仪器：DHG9123A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）、TP-214电子天平（丹佛仪器有限公司）、XMTD-6000恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）、SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵（河南省巩义市予华仪器有限责任公司）、752PC紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麦种子总黄酮的提取 参考许钢等提取黄酮的方法[18-20]，设计藜麦黄酮提取的工艺流程：称取0.5 g干燥粉末→浸提剂浸泡→热回流提取→冷却→过滤→浓缩→定容棕色容量瓶→避光保存备用。

1.3.2 标准曲线的制备[13] 准确称取芸香苷标准试剂5.000 mg，用体积分数为60%的乙醇完全溶解后定容至50 mL，摇匀，得质量浓度为0.1 mg/mL的芸香苷标准溶液；分别吸取芸香苷标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于6支 10.0 mL的试管中，用体积分数为60%的乙醇补至 0.5 mL，加入质量分数为5%的亚硝酸溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min；再加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，混匀，再加入体积分数为60%的乙醇0.4 mL，室温下放置15 min后于波长510 nm处测定其吸光度。取上述中加入溶剂配制的溶液作为空白，于510 nm处比色测定提取液的吸光度。用最小二乘法进行线性回归，得芸香苷标准溶液浓度（C）与吸光度（D）关系曲线的回归方程：D=0.356 3C-0.009 6；r2=0.999 1。

1.3.3 提取液中总黄酮得率的测定 分别取“1.2.1”节所得的待测总黄酮提取液代替芸香苷标准溶液，其他步骤与制作芸香苷标准方程相同。计算公式如下：

总黄酮得率=（C×V1×V2×10-3）/（m/V0）×100%。

其中：C为测定样液的质量浓度，g/L；V0为测定吸光度所用样液的体积，mL；V1为测定时的稀释体积，mL；V2为样液定容后的体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.4 提取条件的选择

1.3.4.1 提取溶剂浓度对总黄酮得率的影响 取浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，料液比为1 g ∶ 30 mL，于60 ℃下热水浴提取60 min，进行总黄酮得率的测定。endprint

1.3.4.2 料液比对总黄酮得率的影响 在提取溶剂浓度为80%时，料液比分别取1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL，于60 ℃下热水浴提取60 min，测定总黄酮得率。

1.3.4.3 提取温度对总黄酮得率的影响 当提取溶剂浓度为80%、料液比为1 g ∶ 30 mL时，分别在50、60、70、80、90 ℃热水浴中提取60 min，进行总黄酮得率的测定。

1.3.4.4 提取时间对总黄酮得率的影响 在提取溶剂浓度为80%、料液比为1 g ∶ 30 mL的条件下分别提取30、45、60、75、90 min，再于60 ℃热水浴中提取60 min，测定总黄酮得率。

1.3.5 正交试验[21] 根据已有数据资料及实际情况，选择提取溶剂浓度、料液比、提取温度、提取时间为考察因素，以测得提取液中的总黄酮得率为考察指标，按照正交表L9（34）设计4因素3水平正交试验。

1.3.6 抗氧化性测定方法

1.3.6.1 DPPH·的清除率[22] 准确称取DPPH·标准品10 mg，溶于无水乙醇中，超声5 min，充分振荡，并定容于 100 mL 容量瓶中，配成0.1 mg/mL DPPH·储备液，置于冰箱中备用。取不同质量浓度的藜麦总黄酮提取液2 mL，分别加入0.1 mg/mL DPPH·溶液2 mL，摇匀，在黑暗中放置30 min，以无水乙醇为空白在波长517 nm处测定其吸光度D样品，用无水乙醇代替DPPH·溶液按上述方法测定吸光度D对照，用无水乙醇代替藜麦种子总黄酮提取液按上述方法测定吸光度为D空白。以维生素C作为阳性对照，按下式计算DPPH·的清除率：DPPH·清除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。

1.3.6.2 ·OH的清除率[23-24] 在试管中依次加入浓度为6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，不同质量浓度的藜麦种子总黄酮提取液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀，静置10 min，再加入6 mmol/L水杨酸溶液2 mL，摇匀，静置30 min，以蒸馏水为空白于波长510 nm处测定其吸光度D样品，用蒸馏水代替水杨酸按上述方法测定吸光度D对照，用蒸馏水代替总黄酮提取液按上述方法测定吸光度D空白。以维生素C作为阳性对照，按下式计算·OH清除率：·OH清除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

2.1.1 提取溶剂浓度对总黄酮得率的影响 从图1可以看出，总黄酮得率随乙醇浓度的增加呈先增加后降低的趋势，于乙醇浓度为80%时达到最大。因此，乙醇浓度以70%～90%为宜。

2.1.2 料液比对总黄酮得率的影响 从图2可以看出，总黄酮得率随提取剂的增加呈先增加后降低的趋势，于料液比为1 g ∶ 30 mL 时达到最大。因此，料液比以1 g ∶ 30～50 mL为宜。

2.1.3 提取温度对总黄酮得率的影响 从图3可以看出，总黄酮得率随提取温度的增加呈“增加—降低—增长”的趋势，

于提取温度为60 ℃时达到最大。因此，提取温度以50～70 ℃ 为宜。

2.1.4 提取时间对总黄酮得率的影响 从图4可以看出，总黄酮得率随提取时间的延长呈先增加后降低的趋势，于提取60 min时达到最大。因此，提取时间以30～60 min为宜。

2.2 正交试验结果

将“2.1”节得到的提取条件结果按照L9（34）正交试验设计因素水平表，L9（34）正交试验设计及其结果见表1和表2。

由表2可以看出，热回流法提取藜麦种子总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B1C2D3，即乙醇浓度为80%，料液比为1 g ∶ 30 mL，在60 ℃下提取60 min时的总黄酮含量最高，可达2.64 mg/g。试验结果与Yuko等的研究结果[25]基本保持一致，具有可靠性。极差值反映的因子影响顺序为B>D>A>C，即料液比对提取率的影响最大。

2.3 抗氧化性试验结果

2.3.1 清除DPPH·效果的测定 DPPH·（二苯代苦味酰自由基） 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，深紫色，在 517 nm 处有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对，而使其颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的。因此，用该波长处的吸光度可检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。抗氧化剂对DPPH·的清除率越高，其抗氧化性越强。藜麦种子总黄酮对DPPH·的清除作用见图5。

由图5可知，藜麦种子总黄酮对DPPH·表现出很强的清除作用，且与浓度呈正相关，IC50值为9.996 μg/mL。试验结果表明其清除能力高于小麦麸皮[26]、生姜[27]等。

2.3.2 清除·OH效果的测定 ·OH是最活泼的自由基，细胞内的H2O2能与Fe2+或Cu2+反应生成·OH。另外，紫外线也能使H2O2均裂生成·OH。同时，·OH也是毒性最大的自由基，它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，且反应速度快[28]。藜麦种子总黄酮对·OH的清除作用见图6。

由图6可知，藜麦种子总黄酮对·OH表现出较强的清除作用，且与浓度呈正相关，其IC50值为56.639 μg/mL，可见其清除能力高于小麦麸皮[26]、小驳骨[29]等。

3 结论

本研究通过正交试验设计优化藜麦种子总黄酮的提取工艺条件，本着溶剂无毒性、易回收、对黄酮溶解力强和工艺简单的原则，确定乙醇为最佳提取剂。试验结果表明最佳工艺条件为：提取溶剂（乙醇）浓度为80%，料液比为1 g ∶ 30 mL，在温度60 ℃下提取60 min。在此条件下，藜麦种子总黄酮得率高达2.64 mg/g。藜麦种子总黄酮对DPPH·和·OH有较好的清除能力，且随着浓度的增加，清除能力增加，清除率分别可达 90.89%、44.90%。其 IC50值分别为9.996、56.639 μg/mL。同时，本工艺在一定程度上节省原料，从而为其用于工业生产方面提供了一定的理论依据。endprint

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