合成Hg-DADPA柱分离含硒或硫化合物的研究

韩维娜，张 震，师 帅，柴 奇，刘学娜*

(1.哈尔滨医科大学药学院，黑龙江哈尔滨150081;2.哈尔滨医科大学大庆校区，黑龙江大庆163319)

研究植物及微生物体内生物大分子的结构修饰，对单一成分的纯化是一个重要且繁琐的过程［1－5］。到目前为止，在组成总核糖核酸(tRNA)中共存在107种不同结构修饰的核苷。越来越多的化学和生物学领域的科学家对硫或硒修饰的tRNA及其功能感兴趣［6］，已发现近23种不同的硫和硒核苷修饰的tRNA［7］。到目前为止，研究微生物体 DNA与RNA的硒和硫结构修饰大多使用同位素示踪法，虽然灵敏度高，但是其放射性限制其在一般实验室的应用。因此，合成新的分离材料一直是一个热点。已有报道表明，用交联葡萄糖凝胶色谱从消化过的核苷酸混合物中选择性地分离出4－和2－硫代尿嘧啶核苷［8］。但是，目前还没有连接到对氯汞苯甲酸的报道。硫与硒在元素周期表中属于同一主族，因此其化学性质相似。如果某些载体能与硫结合，那么就能将含硒化合物分离。根据这个原则，笔者合成了一种新的汞柱，设计路线见图1。

合成的Hg-DADPA色谱纯化化合物是一个可逆过程。通过不同浓度的HCl洗脱，将不同位置硫或硒修饰的核苷酸选择性地分离。该研究方法简单，成本低，不破坏化合物的稳定性。Hg-DADPA色谱的高选择性和高回收率可推广至天然产物中含硫、含硒化合物及未知化合物的富集和分离，为下一步鉴定提供样品。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 HR-MASS质谱仪(美国Waters公司);ZWY-200D恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)。碳酸氢钠(NaHCO3)pH 8.8，偶联缓冲液(0.1 mol/L MES，浓度 0.9%NaCl，pH 4.7)，DADPA 琼脂糖购买于 Thermo公司;对氯汞苯甲酸、1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺(EDC)和UTP购于Sigma公司;2－硫代尿嘧啶(2-SU)、2－硒代尿嘧啶(2-SeU)和4－硒代尿嘧啶核苷(4-SeUTP)由实验室提供。Baseline-ZEROTMDNase，RNase A，RiboShredderTMRNase Blend购买于Epicentre公司。

LB的组成:分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化钠，加1 L双蒸水，定容，加热搅拌至溶解，灭菌后，在室温下放置，备用。

图1 设计路线

1.2 Hg-DADPA色谱的合成 取3 ml二氨基二异丙基琼脂糖 DADPA(16 ～20 μmol氨基/ml树脂)，加入到0.5 cm ×8 cm柱中(最后柱床高度1 cm)，自由滴下，使存储的缓冲液耗尽后，分3次加入偶合缓冲液(0.1 mol/L MES，浓度0.9%NaCl，pH 4.7)，每次 3 ml，冲洗干净。在整个过程中，不要使树脂床干燥;平衡树脂，最后添加偶合缓冲液9 ml，转移DADPA琼脂糖至25 ml容量瓶中。取0.306 mmol对氯汞苯甲酸，溶解到6 ml二甲基甲酰胺中，混合几分钟，溶解后转移到 25 ml容量瓶中。另取0.774 mmol的 EDC 0.3 ml，溶解到偶合缓冲液中，然后加入装有树脂的圆底烧瓶中，在室温下搅拌，经过18 h反应，树脂转移到层析柱中，并且添加洗涤缓冲液(0.1 mol/L NaHCO3(pH=8.8))，洗涤至澄清，放至 4℃保存，备用。

1.3 Hg-DADPA色谱分离混合物 混合4-UTP、UTP、2-SU和2-SeU，使用Hg－DADPA色谱柱分离。步骤如下:使用移液器分别取2 μl的 10 mmol/L UTP(A)、2-SU(B)、2-SeU(C)和4-SeUTP(D)，混合，然后加入1.8 ml双蒸水作为样品。使用Hg-DADPA色谱分离样品，洗脱剂分别是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脱的馏分都要通过紫外全波长扫描检测，合并相同样品。其中，在13管、14管之间加双蒸水10 ml，洗脱残存的碳酸氢钠。

A=ECL计算样品回收率(n=3)

1.4 从大肠杆菌菌株K12(MG1665)提取tRNA 添加少量的大肠杆菌于LB中，4℃过夜，离心(6 000 r/min)8 min，弃上清液;留下约250 μl液体;加入含1 ml蛋白酶K组织和300 ml细胞裂解液，涡旋振荡5 min，65℃孵育120 min，再将样品置于冰上15 min，添加含175 ml的MPC蛋白沉淀试剂300 ml溶解样品，涡旋振荡1 min，4℃，离心(13 000 r/min)30 min;加入500 ml异丙醇，回收上清液;颠倒离心管30～40次，4℃离心20 min，小心倒出异丙醇;用浓度70%乙醇漂洗2次，不要接触沉淀;离心，用移液管取出所有残留的乙醇，得到总DNA和总RNA;加入6 ml不含RNA酶的游离水后，再加入 Baseline-ZEROTMDNase 200 μl(10 ×缓冲液，0.69 ml)，37℃过夜;加入0.77 ml 3 mol/L NaCl，然后加入8 ml异丙醇，颠倒离心管30～40次;4℃，离心(3 000 r/min)30 min，得到tRNA。重复1次。

1.5 tRNA的消化和含硫核苷酸化合物的富集 将tRNA重新溶于3 ml双蒸水中，加入0.5 ml 5 μg/μl的 RNA 酶 A，混匀，并在37℃过夜孵育。然后，经Hg-DADPA色谱柱分离含硫或硒的核苷酸，洗脱剂分别是 0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中 0.6 ml/管，每份洗脱的馏分都要通过紫外全波长扫描检测，合并相同样品。

1.6 含硫核苷酸化合物的鉴定 水解tRNA后，经过Hg-DADPA色谱富集含硫、含硒核苷酸化合物，得到样品A和B，将样品经HPLC分析。HPLC条件如下:PRP-1反相柱，流速1 ml/min，柱温25℃，流动相A为10 mmol/L TEAAc(pH 7.1)，流动相 B为含浓度60%CH3CN的10 mmol/L TEAAc(pH 7.1)。梯度洗脱，0～15 min 100%B，16～20 min 100%A到30%B，检测波长260、326 nm。对HPLC的每个组分进行ESI(-)-MS和HR-MS鉴定。

2 结果与分析

2.1 合成DADPA-Hg柱对混合物的分离和回收率测定 混合的UTP(A)、2-SU(B)、2-SeU(C)和4-SeUTP(D)有不同的最大紫外吸收峰，分别为260、300、307、365 nm。柱层析洗脱次序见图2。重复3次，使用计算公式:A=ECL，计算样品回收率，式中A代表吸光度;E代表吸光系数;C代表浓度;L代表比色皿厚度。UTP、2-SU、2-SeU、4-SeUTP的回收率分别约73%、87%、90%、85%(n=3)。Hg-DADPA色谱柱能够高效地通过不同浓度的HCl洗脱剂分离不同含硫或硒的化合物，且可重复使用。

2.2 样品稳定性 由表1可知，室温放置4 d后，2－硒代尿嘧啶核苷比4－硒代尿嘧啶核苷稳定，在酸性条件下4－硒代尿嘧啶核苷几乎100%降解;硒取代的化合物在中性和碱性条件下比酸性条件下要稳定，其中在中性条件下化合物几乎没有发生降解，pH越低，化合物的稳定性越差。2－硒代胸腺嘧啶核苷和4－硒代胸腺嘧啶核苷具有同样的试验结果，即2位比4位稳定，在酸性条件下化合物具有不稳定性。

2.3 未消化前提取大肠杆菌得到tRNA的总量和纯度 从1 L大肠杆菌中提取得到9 ml的RNA，取2 μl稀释到800 μl水中，得到紫外图谱，计算A260/A280=1.96，表明RNA纯度达到90%以上。

2.4 tRNA的消化和含硫、含硒核苷酸化合物的富集 0.1 mol/L盐酸洗脱液在326 nm处有吸收(11～13管，样品A)，0.5 mol/L盐酸洗脱液在326和260 nm处均有吸收(样品B)，通过紫外检测，大致能够判断水解程度，A260/A326为4～10(样品B)，判断RNA没有彻底水解，每个修饰上面大概平均连接有4～6个未被修饰的碱基。由图3可知，所有馏分均显示在256 nm处有吸收。这可能由于是核苷酸降解后产生不完全水解。然而，11～13管均在326 nm处有强吸收，故此合并作为样品A，将进一步分析326 nm峰的组成。

表1 UTP、2-SU、2-SeU和4 SeUTP在不同溶剂、不同时间下的稳定性

图2 Hg-DADPA柱对硫硒修饰不同位置化合物的分离

图3 tRNA消化后，富集含硫及含硒核苷酸化合物

图4 加入不同浓度B2A6和不同pH样品A反应的紫外图谱

2.5 样品A的鉴定与分离

2.5.1 样品A的鉴定。首先，以B2H6为还原剂，加入后发现没有造成任何紫外吸收峰的改变(图4)。但是，样品A对pH敏感，尤其是在碱性条件下。样品吸收峰在酸性条件下转变非常缓慢，而在碱性条件下pH改变吸收峰也迅速发生改变。根据吸收峰的数值，这些变化可能是硫取代的核苷(硫尿嘧啶核苷)造成的。因此，据预测，样品A主要是寡核苷酸，且含有硫尿嘧啶的结构。

2.5.2 样品A的分离。样品A经过高效液相分析，收集到6个不同的组分，前5个无色，第6个黄色(图5)。

2.5.3 化合物鉴定。对HPLC的每个组分进行ESI(－)-MS and HR-MS鉴定。通过ESI(－)-MS(图6)，分析所有的组分。684 m/z(M+－1)存在于后3个组分中，而668 m/z(M+－1)在6个组分中都存在，742 m/z(M+－1)存在于后3个组分中。水解RNA的酶核糖核酸酶A(RNA酶A)是一个内源性的残留3'端嘧啶，最终形成3'－嘧啶－3'－磷酸寡居核苷酸，因此根据紫外吸收峰和HR-MS，这2个峰分别对应到鸟嘌呤－2－硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤－3－硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤－5－甲酰－2－尿嘧啶核苷酸(表2、图7)。

表2 大肠杆菌的tRNA消化后的核苷酸通过HR-MS的修饰和鉴定

3 讨论

使用二氨基二异丙基琼脂糖(DADPA)与对氯汞苯甲酸进行反应，得到Hg-DADPA色谱。用不同浓度的盐酸洗脱不同位置取代的硫或硒修饰化合物。这个反应是一个可逆反应。当增加HCl用量时，被Hg-DADPA色谱反应结合的产物会被游离出来，从而被洗脱，而当更换成其他酸时，不能达到洗脱和分离。Hg-DADPA色谱对酸是稳定的，因此Hg-DADPA色谱的再生可以使用0.5 mol/L HCl洗脱除杂，从而活化。Hg-DADPA还具有一些优点，如可重用性和高可靠性、高回收率。试验结果显示，最低的回收率达80%以上。该研究材料将帮助含硫和含硒修饰的内源性大分子的富集，从而有助于进一步确定生物大分子的修饰位置。

图5 HPLC分析和分离样品A

图6 大肠杆菌的tRNA消化后的核苷酸HR-MS

图7 化合物结构

使用合成的汞柱对来自大肠杆菌K12的tRNA中的含硫、含硒化合物分离，通过HR-MS鉴定得到鸟嘌呤－2－硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤－3－硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤－5－甲酰－2－尿嘧啶核苷酸3个化合物。消化时使用RNA酶A，存在如下原因:核糖核酸酶A是一个内源性的核糖核酸酶，将最终水解得到3'－嘧啶－3'－磷酸根［9－10］。分离、富集后在326 nm处的吸收峰是类似合成的4－硫尿嘧啶核苷酸(峰值在330 nm处)。根据这一特点，进一步通过ESI-MS和HR-MS确定大肠杆菌核苷酸的RNA的G-4-硫代尿嘧啶核苷酸、A-3-硫代尿嘧啶核苷酸及G-5-甲酰-4-硫代尿嘧啶核苷酸。然而，没有发现硒修饰核苷酸。可能的原因是已知的自然发生的硫和硒核苷在所有类型的RNA修饰中非常低，因此下一步将扩大培养。

总之，已合成新的Hg-DADPA色谱，可用于分离硫和硒修饰的RNA。这是一个经济和安全的纯化方法，具有重复性和选择性。2005年，上海交通大学的科学家已发现一种新的DNA修饰，即DNA修饰中含有硫。这在核酸的研究上属于里程碑的科学文件［11－12］。这表明含有硒的DNA或RNA的修饰也可能存在于其他生物体中，或存在于更特殊的自然条件下生存的生物(如陨石坑的植物和微生物)。合成汞柱将有助于富集含硫含硒DNA或RNA修饰，使得检测简化，同时避免同位素对人体的伤害。今后，将使用这种新合成的Hg-DADPA色谱从天然植物中富集硫和硒衍生物。

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