基于响应面法的土霉素高产菌株S189发酵培养基优化

王 明(1．天津科技大学生物工程学院，天津300457;2．宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏银川750101)

土霉素(Oxytetracycline，OTC)是20世纪40年代发现的四环素族成员，是一种广谱抗菌药物，在医疗、畜牧业和农业领域具有广泛的用途和广阔的市场前景［1］。目前土霉素均采用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)通过发酵法生产。影响土霉素发酵产量的因素较多，主要包括菌株自身的生产能力、发酵培养基以及发酵条件参数，其中研究主要集中在生产菌株的选育［2－4］。在工业化生产中，由于土霉素发酵培养基组成较复杂，玉米浆、黄豆饼粉等原料质量差异较大，易带来发酵过程与目标产物产量的波动。响应面方法(Response Surface Methodology，简称RSM)在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中实际问题的一种有效方法，已广泛应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域［5－7］。目前宁夏泰瑞制药股份有限公司土霉素生产工艺优化课题组采用菌种诱变技术成功筛选得到一株土霉素高产菌株S189，笔者采用响应面法优化发酵培养基，为该菌株发酵性能的发挥提供良好条件。

1 材料与方法

1．1 菌种 土霉素高产菌株:龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)S189，由宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究所保存。

1．2 培养基 斜面培养基:麸皮70 g/L和琼脂25 g/L，pH调至6．8 ～7．0。种子培养基:淀粉 16 g/L，糊精 12 g/L，黄豆饼粉5 g/L，玉米浆2 g/L，硫酸铵4 g/L，氯化钠4 g/L，碳酸钙4 g/L。发酵培养基:黄豆饼粉25 g/L，玉米浆8 g/L，淀粉75 g/L，硫酸铵8 g/L，氯化钠2 g/L，碳酸钙6 g/L，磷酸二氢钾0．3 g/L。配制培养基时先用培养基总体积50%的纯化水将淀粉溶解后，加入淀粉总质量0．006 5%的高温淀粉酶，放入沸水浴中边搅拌边糊化，约20 min，再于其他成分混合配制。

1．3 培养方法 斜面培养:(36．5 ±1．0)℃，65 ～72 h，(30．0±1．0)℃，20～24 h。种子培养:将已生长好的斜面孢子刮(2～3)cm2至种子培养基中，(30．0 ±1．0)℃，230 r/min 培养20～24 h。发酵培养:用吸管吸取一定量已生长好的种子液，接入发酵瓶中，(30．0 ±1．0)℃，230 r/min 培养150 ～192 h。

1．4 分析方法 将发酵液用草酸酸化至pH 1．50～1．70，放置5 min，用中速滤纸过滤至5 ml以上，吸取滤液稀释适宜倍数(使稀释后效价在标准曲线范围内)，用移液管吸取1 ml稀释液于试管中，准确加入0．01 mol/L盐酸，使总体积为20 ml，再加入0．05%(g/ml)的三氯化铁溶液10 ml，使总体积为20 ml，摇匀，放置20 min。另取1 ml稀释液，加入0．01 mol/L的盐酸19 ml，使总体积为20 ml，摇匀，放置20 min，作为空白，放置20 min。在480 nm波长下测定2种液体吸光度。将测定的吸光度值代入标准曲线方程，再乘以稀释倍数即得效价。土霉素效价的测定:采用紫外分光光度计法，参照文献［2］。

1．5 Packett-Burman试验设计(简称PB试验) 根据前期发酵经验和单因素试验结果，选取培养基中7个因素，进行N=12的 Packett-Burman设计试验，筛选出重要影响因子［8－10］。

1．6 最陡爬坡试验 响应面拟合方程只有在接近最佳值区域才近似真实情况，因此要先逼近此区域才能建立有效的响应面拟合方程，通常用最陡爬坡法快速逼近最佳值区域。最陡爬坡法以PB试验结果为依据，爬坡路径与主要因素的效应一致。对筛选出的因子根据方程进行最陡爬坡设计，以坡的最高点作为后续中心组合的中心点。

1．7 响应面分析 根据PB和最陡爬坡试验结果找到的中心点，利用Design-Expert响应面分析中的中心组合设计方法(CCD)进行试验［8］，得到优化后的理论结果，进行3次重复验证。

2 结果与分析

2．1 PB试验设计及影响显著因子的确定 采用Design-Expert．V8．0．6 软件中 Packett-Burman 试验设计，根据龟裂链霉菌的发酵特点，采用N=12的PB设计表，对发酵培养基中黄豆饼粉(A)、玉米浆(B)、淀粉(C)、硫酸铵(D)、氯化钠(E)、碳酸钙(F)、磷酸二氢钾(G)7个因素进行考察。每个因素取高、低2个水平，培养160 h，发酵液经草酸酸化过滤后采用分光光度计检测土霉素效价(mg/L)，作为PB试验的响应值(Y)，另设3个虚拟变量，考察试验误差，试验设计及结果分析见表1、2。

表1 PB试验因素水平及编码 g/L

表2 PB试验设计与结果

方差分析结果表明，PB试验中变量A、变量B、变量F均显著。变量A、B、F的模型贡献率较高，为构成模型的主要因素。因此，玉米浆、黄豆饼粉、碳酸钙是影响土霉素发酵效价的重要因素，利用软件可得到关于响应值的多元一次回归方程:Y=21．28+2．66 A+1．68 B+1．31 C －0．21 D+0．28 E+2．59 F+0．042 G，R2=0．929 2，所选模型显著。

2．2 爬坡试验 最陡爬坡法以PB试验结果为依据，爬坡路径与主要因素的效应一致。黄豆饼粉、玉米浆、碳酸钙均呈正效应增加，根据这3个因素效应大小的比例设定他们的变化方向及步长。试验设计及结果见表3，由表3可知，最佳条件为试验3，因此选取黄豆饼粉40．0 g/L，玉米浆15．0 g/L，碳酸钙12．0 g/L作为优化试验的中心点。

表3 最陡爬坡试验设计及结果

2．3 中心组合试验及响应面分析 根据PB和最陡爬坡试验结果，采用黄豆饼粉40 g/L，玉米浆15 g/L，碳酸钙12 g/L为中心点，利用Design-Expert响应面分析中的中心组合设计方法(CCD)进行试验［11］，结果见表 4。

表4 中心组合设计及试验结果

利用Design-Expert软件进行二次回归，得到响应值拟合方程 R1=+28．85+1．40A+1．43B+1．25C －0．15AB －0．28 AC+0．075BC －2．00A2－1．24B2－0．45C2。由此方程进行方差分析，结果表明，建立的回归模型显著(P＜0．05)，说明方程拟合度较好;Pr失拟项并不显著，说明残差由随机误差而引起，模型选择正确;模型相关系数R2=0．916 6，接近1，表明模型拟合较好，能够较好地描述该试验结果。

由回归方程所作出的响应面立体分析图(图1～3)显示，它们分别反映了黄豆饼粉、玉米浆、碳酸钙这3个因素之间两两交互作用对响应值的影响，通过比较相应曲面的陡峭性状，可以看出因素A、B、C都随着量的加大土霉素效价逐步升高，当超过最佳值时，土霉素效价开始下降。

利用软件Numerical Optimization功能预测响应值最大值时，模型各因素的组合为黄豆饼粉41．0 g/L、玉米浆16．4 g/L、碳酸钙 12．8 g/L，预测效价为 30．25 mg/L。

图1 玉米浆和黄豆饼粉对效价的影响

图2 碳酸钙和黄豆饼粉对效价的影响

图3 碳酸钙和玉米浆对效价的影响

2．4 验证试验 为验证模型预测的准确性，以响应面试验确定的主要因素最优组合配制培养基进行发酵，重复3次，同时以优化前的原始发酵培养基作为对照。结果显示，土霉素平均产量由24．34 mg/L上升到29．8 mg/L，与预测结果接近，说明响应面分析得到的最优发酵培养基与预测结果接近。

3 结论与讨论

微生物次级代谢产物的产生受到非常复杂的调节，发酵培养基对代谢产物的产量有较大影响，通过改变发酵培养基种类或优化发酵培养基成分，可以提高微生物次级代谢产物的产量。

该研究筛选出影响土霉素产量的3个因素——黄豆饼粉、玉米浆、碳酸钙，再通过最陡爬坡试验和CCD试验进行优化与评价，得到影响土霉素的二次多项式回归模型，利用统计学方法对该模型进行显著性检验，在含有黄豆饼粉41．0 g/L、玉米浆16．4 g/L、碳酸钙12．8 g/L培养基成分组成下，土霉素摇瓶产量预测值达30．25 mg/L。经验证试验S189菌株经发酵产量可达29．8 mg/L，与理论预测值基本吻合，比优化前提高24．3%，由此可见，应用响应面法进行发酵培养基的优化，提高微生物次级代谢产物的方法是经济有效、科学合理的。

［1］段丽丽，沈建忠．四环素类药物作用研究进展［J］．兽医兽药，2005(1):41－43．

［2］谢梅冬，余莲，邓伟泉．紫外分光光度计测土霉素含量［J］．广西畜牧兽医，1994，10(3):8 －20

［3］边艳青，李保荣，石振华，等．耐磷酸盐土霉素菌株选育和发酵的研究［J］．中国抗生素杂志，2003，28(8):456 －458．

［4］沈云鹤，梁洁．正交设计法降低土霉素发酵培养基成本的初步研究［J］．开封医专学报，1997，16(3):5 －8．

［5］刘省伟，赵德．用均匀设计优化达托霉素发酵培养基［J］．中国抗生素杂志，2011，36(3):4 －7．

［6］THOMPSON D R．Response surface experimentation［J］．J Food Proc Pres，1982，6:155．

［7］褚以文．微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件［J］．国外医药·抗生素分册，1999，20(2):58 －66．

［8］吴克刚，柴向华，杨连生．破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)产DHA的营养条件研究［J］．食品与发酵工业，2003，29(2):42 －47．

［9］蔡友华，范文霞，刘学铭，等．响应面法优化巴西虫草发酵培养基的研究［J］．食用菌学报，2007，14(2):55 －59．

［10］AHUJA S K，FERREIRA G M，MOREIRA A R．Application of Plackett－Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium［J］．Biotechnology and Bioengineering，2004，85(6):666 －675．

［11］蒙哥马利D·C．实验设计与分析［M］．汪仁官，等，译．3版．北京:中国统计出版社，1998:591－641．