应用酶联免疫法快速检测水产品孔雀石绿残留

曾 蓉，王明力

(1．贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳 550025;2．贵阳市农产品质量安全监督检验测试中心，贵州贵阳 550081)

孔雀石绿(MG)是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，作为杀真菌剂和消毒剂被广泛应用在水产养殖上［1］。孔雀石绿被鱼体吸收后会代谢为危害更大的隐形孔雀石绿(LMG)和隐形结晶紫(LCV)，并沉积于脂肪组织，经研究发现孔雀石绿具有高毒、高残留、致畸、致癌、致突变等副作用，残留时间达到100 d以上，目前许多国家已禁用孔雀石绿。日本、美国、欧盟已不允许其作为兽药用于水产养殖上。我国在2002年在《动物性食品中兽药残留最高限量》(农业部公告235号)中将孔雀石绿列为禁用药［2］，在动物性食品中不得检出。但因其价格低廉，在水霉病防治方面尚未有很好的替代品，所以在水产养殖、运输过程中仍有违规使用，在不同程度上存在禁而不止的现象［3］。

随着科学技术的发展，检测水产品中孔雀石绿、结晶紫类物质的手段和方法多种多样，检测仪器越来越灵敏。常见方法有国家标准、ELISA试剂盒和胶体金试纸3类。2006年我国颁布了国家标准GB/T20361－2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》［4］，该标准方法的准确度较高，但检测步骤多，样品前处理繁琐、费时、检测成本高，使用有机溶液量大，仪器设备昂贵，不适于对大量样品进行低成本快速筛选、现场判定的需要。如何采用最快捷、最经济、最准确的检验方法，是食品安全的一项重要研究内容，就目前的发展趋势看食品安全检测方法首先要体现快速，因为食品生产者、经营者、监督者都需要准确而又及时的监控结果。鉴于此，笔者选用一种酶联免疫试剂盒分别对市场抽取43份水产品中孔雀石绿残留量进行了速测，旨在为水产品安全检测提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器。电子天平(瑞士梅特勒公司)、离心机(上海安亭仪器厂)、微孔酶标仪(美国宝特公司)、洗板机(美国宝特公司)、旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)、氮气吹干装置(瑞士Buchi公司)、离心管、微量移液器(单道 20～200 μl、100～1 000 μl)。

1．1．2 试剂。乙酸乙酯(分析纯)、冰乙酸(分析纯)、正己烷(分析纯)、孔雀石绿隐性高浓度标准品(2．5 μg/L)、孔雀石绿ELISA检测试剂盒(力德力诺生物技术有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 样品制备与提取。水产品样品去除非食用部分，用匀浆器均质样品;称取(1．00±0．05)g匀浆样品至50 ml离心管中，加入10 ml冰醋酸－乙酸乙酯(1∶99，V/V)溶液，剧烈振荡2 min;室温下4 000 r/min离心10 min，取1 ml上层液于离心管中，加入氧化剂液50 μl，轻轻摇匀后室温避光放置3～5 min;40℃氮气吹干，吹干后立即加入1 ml样品稀释液，再加入1 ml正己烷，涡动20 s混匀，4 000 r/min离心5 min;去除上层有机相，取下层水相50 μl进行检测。

1．2．2 酶标板操作。取出所需的酶标板孔，在每孔中加入50 μl工作标准品 (0、0．1、0．3、0．9、2．7、27．0 ng/ml)和样品于所设定的孔中。在每孔中加入50 μl抗体，轻敲微孔板边缘1 min混匀。25℃避光环境中反应30 min。

洗板4～5次，每次应该加入250 μl 1倍洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干。加入100 μl酶标物，轻敲微孔板边缘混匀，在25℃下避光培养30 min。重复洗板步骤，加入底物A液50 μl，再加底物B液50 μl，轻轻振荡混匀，25℃下避光反应15～20 min。加入50 μl终止液终止反应，在450 nm波长下测定每孔OD值。

1．2．3 样品加标回收率试验。用已检测的阴性样品做基体空白，取(1．00 ±0．05)g匀浆样品，分别加入 0．1 μg/ml孔雀石绿标准溶液 100、300、500 μl，每个浓度2 个平行，采用该试验方法测定回收率。

2 结果与分析

2．1 孔雀石绿的标准曲线 结果表明，孔雀石绿含量(x，ng/ml)与吸光度之比(y=B/B0，%)的线性方程为:y=－22．889lnx+30．763，R2=0．998 7(图1)。

表1 不同浓度样品加标回收率

2．2 样品中孔雀石绿检测结果 共检测样品43份，其中检出阳性结果样品有3份，残留量分别为2．137、1．581、1．439 μg/kg，检出率为6．98%。均超过水产品中孔雀石绿限量标准1．000 μg/kg。

2．3 样品加标回收率 由表1可知，水产品中孔雀石绿的平均回收率为78．27% ～88．73%，表明试验方法回收率稳定、可靠。

3 讨论

样品检测如为阴性结果，可直接排除水产品中含有孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留;如为阳性结果，需进一步用高效液相色谱法或液相色谱－串联质谱确证和定量。该试验中检出的3份阳性样品用高效液相色谱法确认后，均检出含有孔雀石绿残留。

ELISA试剂盒的所有试剂需要恢复至20～25℃保证灵敏度，吸附试验中溶液每次加量要严格相同，酶标板洗板时确保干净，甩干并在吸水纸上吸干后使用。

酶联免疫快速检测技术相对传统和经典的化学检测和仪器检测而言，其特点是检测所需的时间相对较少，对仪器设备、操作人员等条件要求不高，样品前处理简单，既快速方便又节约成本，可满足水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的筛选以及疑似样品的确证，应用前景广阔，有利于政府监管并指导企业自控，促进水产品卫生质量的提高，保护消费者身体健康，提高我国水产品的国际竞争力。

［1］史东杰，孙向军，梁拥军，等．水产品中孔雀石绿残留检测的ELISA与HPLC 法的比较［J］．现代渔业信息，2009，24(4):11－14．

［2］农业部．中华人民共和国农业部公告第235号:动物性食品中兽药最高残留限量［S］．2002．

［3］王丽玲．应用快速检测试剂盒预测水样和水产品中孔雀石绿［J］．实用预防医学，2007，14(6):1900 －1901．

［4］郑斌，赵红萍，冷凯良，等．GB/T20361－2006，水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定［S］．北京:中国标准出版社，2006．