黄瓜霜霉病生防菌株的筛选及防病促生研究

黄瓜霜霉病生防菌株的筛选及防病促生研究

陈颖潇1，何 胥2，施洁君3，张丽娜1，谷 春2，王 光2，郭坚华1*

(1.南京农业大学植物保护学院植物病理学系，江苏南京 210095；2.江苏省安丰生物源农药工程中心有限公司，江苏太仓 215400；3.江苏省太仓市农业委员会，江苏太仓 215400)

摘要[目的]筛选黄瓜霜霉病的生防菌株, 为黄瓜霜霉病的生物防治和生防菌制剂开发奠定基础。[方法]通过温室试验和大田试验研究生防菌株对黄瓜霜霉病的防效以及对黄瓜的促生作用。[结果]温室试验结果表明，人工接种霜霉病病原菌20 d后，34株细菌中有7株对黄瓜霜霉病的防治效果在50%以上，其中TDGN2的防治效果最好，防效达到64.65%；有7个菌株对黄瓜苗生物量的增加量超过20%。大田试验结果表明，温室条件下防效和促生效果较好的DS22、TDJN4和THGB4 3个菌株中TDJN4对黄瓜霜霉病的防效均超过50%；生防菌株处理的黄瓜叶绿素总含量均显著高于清水对照。[结论]生防菌株TDJN4对黄瓜霜霉病表现出一定的防病促生效果，具有广阔的应用前景。

关键词黄瓜霜霉病；生防菌株；防效；促生

中图分类号S436.421.1+1

基金项目苏州科技支撑计划项目(SNG201232)。

作者简介陈颖潇和何胥为共同贡献作者。陈颖潇(1990- )，男，江苏溧阳人，硕士，从事植物病害生物防治研究。何胥(1987- )，男，江苏宜兴人，助理农艺师，从事作物栽培技术研究。*通讯作者，教授，从事植物病害生物防治研究。

收稿日期2015-06-11

Screening of Biocontrol Strain against Cucumber Downy Mildew and the Preliminary Study of Disease Prevention and Hygiene Promotion

CHEN Ying-xiao1, HE Xv2, SHI Jie-jun3, GUO Jian-hua1*et al(1. Plant Pathological System, College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095; 2. Jiangsu Ann and Bio-source Pesticide Engineering Center Co., Ltd., Taicang, Jiangsu 215400;3.Taicang Agriculture Committee,Taicang,Jiangsu 215400)

Abstract[Objective] Biocontrol strains against cucumber downy mildew were screened out to lay the basis for biological control of Pseudoperonospora cubensis on cucumber and development of biological agents. [Method] Control efficiency and growth-promoting effects of biocontrol strains of cucumber downy mildew were studied through greenhouse and field experiments. [Result] Greenhouse experiment results showed that after the artificial was inoculated into downy mildew pathogen for 20 d, 7 of 34 strains of bacteria could control cucumber downy mildew more than 50%, among them TDGN2 had the best prevention, and its control efficiency reached 64.65%. There were seven strains of cucumber seedlings to increase biomass volume more than 20%. Field test results showed that TDJN4 had cucumber downy mildew control effect more than 50%; the total chlorophyll content of cucumber biocontrol strains were significantly higher than those treated water treatment. [Conclusion] TDJN4 had great effects on disease prevention and growth-promoting against cucumber downy mildew, it would have a broad application prospect in the future.

Key wordsPseudoperonosporacubensison cucumber; Biocontrol strain; Biocontrol efficiency; Plant-growth promotion

黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk．&Curt．)Rostov]引起的一种气传病害，是世界黄瓜生产区的重要叶部病害之一[1]，也是保护地黄瓜上的一种毁灭性病害，有70多个国家先后发生过该病害[2]。近年来，随着保护地黄瓜种植面积的不断增加，黄瓜霜霉病的危害逐年加重，现已成为制约温室大棚黄瓜产量的重要因子。种植抗病品种[3]和使用化学药剂是目前防治该病害的主要方法，但是抗病育种工作周期长，化学药剂的反复使用易产生抗药性[4]且污染环境。因此，生物防治策略成为该病害防治研究的新方向。笔者从前期初步筛选的菌株中选取34个菌株，通过温室试验和大田试验对其防治效果、促生作用进行了评价，旨在为该病的生物防治和生防菌制剂开发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料34个供试菌株均由南京农业大学植物保护学院植物病理学系生物源农药研发试验室和江苏省安丰生物源农药工程中心有限公司共同筛选。供试植株为黄瓜霜霉病中抗品种“申青一号”。

1.2方法

1.2.1生防菌剂、病原菌孢子囊悬浮液制备和植物材料培育。

1.2.1.1生防菌剂的制备。将供试菌株在 LB(LB配方：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，调节pH为7.2)。平板上划线，28 ℃生化培养箱中培养 14～16 h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有 5 ml LB 培养液的试管中，置于 28 ℃、200 r/min的摇床中培养，制成种子液；以1%的接种量将种子液接种于装有 500 ml LB 培养液的三角瓶中，置于 28 ℃、200 r/min 的摇床中培养 48 h，待菌液浓度达到1×109cfu/ml 时稀释待用。

1.2.1.2黄瓜霜霉病病原菌孢子囊悬浮液制备[5]。傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(采集前 7 d 未施用化学农药)，用无菌水冲去叶面杂物和原有的孢子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于 18 ℃培养箱中黑暗保湿培养 24 h。用毛笔刷取新长出的孢子囊转入无菌水中，稀释至1×105孢子囊/ml，在18 ℃培养箱中黑暗培养2～3 h，待有大量游动孢子囊出现时使用。

1.2.1.3植物材料培育。将黄瓜种子进行表面消毒(70% 无水乙醇表面消毒1～2 min，0.05%次氯酸钠溶液浸泡10 min，灭菌水润洗5次)，播种于育苗盘中，置于 28 ℃、光暗周期为16∶8 h、相对湿度大于70%的温室中进行培育。待黄瓜苗长到2片真叶时进行移栽。将黄瓜幼苗移栽装满基质的盆钵，每钵1株，置于28 ℃、相对湿度大于85%、光暗周期为16∶8 h的温室中培养。

1.2.2温室防效和促生试验。

1.2.2.1生防菌剂防治黄瓜霜霉病的温室试验。按照“1.2.1.3”方法培育黄瓜苗，待其长出4片真叶时进行灌根和喷雾处理。试验共设34个生防菌处理和1个清水对照处理，每个处理4次重复，每个重复12株苗。灌根处理菌液浓度为1×108cfu/ml，每株苗用量为25 ml，缓慢浇灌于黄瓜根部。喷雾处理菌液浓度为5×107cfu/ml，按照0.01%的终浓度加入表面活性剂吐温20，均匀喷雾于黄瓜叶片。喷雾的标准是：每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉落为准，黄瓜叶片正反面都要喷施。对照处理采用清水处理。生防菌处理5 d后喷雾接种病原菌，接种病原菌20 d后调查病害严重度并计算生防效果。

病害严重度分级标准[5]：0级，无病症；1级，接种点有轻微病斑，其直径小于0.5 cm；3级，病斑直径为0.5～1.3 cm；5级，接种点黄化面积占子叶面积1/2 以下，坏死面积占1/3以下；7级，坏死斑面积占叶面积的1/3～2/3；9级，坏死斑面积占叶面积2/3以上或全株枯死。

病害严重度=∑(各级病株数×级值)/(调查总株数×最高级值)×100%

防治效果=(对照组病害严重度-处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100%

1.2.2.2生防菌剂对黄瓜苗温室促生试验。按照“1.2.1.3” 方法培育黄瓜苗，待其长出4片真叶时进行灌根和喷雾处理。试验共设34个生防菌处理和1个清水对照处理，每个处理4次重复，每个重复12株苗。生防菌处理后30 d测量黄瓜株高、叶面积以及测定鲜重、干重和生物量增加等指标。

生物量增加=(处理组植株鲜重-对照植株鲜重)/对照植株鲜重×100%

1.2.3大田试验。

1.2.3.1生防菌剂防治黄瓜霜霉病大田试验。2013年在江苏省太仓市现代农业园内日光大棚开展大田防效试验。种植方式为直播，种在大型盆钵中，使用的营养土为进口基质。试验采用随机区组设计，设3个生防菌处理和1个清水对照处理，每个处理4次重复，每个重复24株苗，小区间设有保护行。在黄瓜长出5～6片真叶时进行第1次处理。喷施生防菌剂为30 ml/株，对照组用等量清水以相同方法喷雾，喷施时均加入终浓度为0.01%的表面活性剂吐温20。大田试验采用标准的田间管理模式，并且不再使用其他杀菌剂。生防菌剂间隔 10 d 施药一次，在黄瓜的整个生长期间共施药3次；于初次喷雾后7、17和27 d 调查病害并记录。大田病害调查中黄瓜霜霉病分级标准[6]：0级，无病斑；1 级，病斑面积占整个叶面积的 5%以下；3 级，病斑面积占整个叶面积的 6%～10%；5 级，病斑面积占整个叶面积的 11%～25%；7级，病斑面积占整个叶面积的 26%～50%；9 级，病斑面积占整个叶面积的50%以上。喷雾的植株每张叶片均调查。防效计算方法同“1.2.1.3” 。

1.2.3.2黄瓜叶片叶绿素含量测定。参照曾建敏等[7-8]的方法，具体操作步骤：于生防菌株第1次处理后30 d采集植株顶部叶片，将植物叶片去脉剪碎，称取0.5 g放入25 ml容量瓶中，每个处理3次重复。用提取溶剂(用体积比为2∶1的丙酮-无水乙醇混合液配成95%的水溶液)定容，放于25 ℃恒温培养箱中暗提取24 h，直至组织变白。在663、645 nm波长下以提取溶剂作空白分别测定样品液的吸光度。

叶绿素浓度(mg/L)按下列公式计算：叶绿素a(Ca)=12.7A663-2.59A645；叶绿素b(Cb)=22.9A645-4.67A663；总叶绿素(Ct)=Ca+Cb。叶绿素含量按下式计算：叶绿素含量(mg/g鲜样)=C×提取液总体积/样品重×1 000。

1.3数据处理所有数据采用 Excel 和 DPS 7.05 版软件进行方差分析，并用LSD法比较各处理间的差异显著性。

2结果与分析

2.1生防菌株对黄瓜霜霉病的温室防效试验选用已经筛选到的对多种病原菌具有拮抗作用的34株生防菌作为黄瓜霜霉病温室盆栽防效测试菌株。温室条件下，接种病原菌孢子囊 20 d 后，34株细菌中有7株对黄瓜霜霉病的防治效果在50%以上(表1)，其中TDGN2的防治效果最好，达到64.65%，TDGN5的防治效果为61.53%，3BY4的防治效果为60.18%，DS22、TDJN3、TDJN4和TDJN7的防治效果在50%～60%。7个生防菌处理和对照相比，病害严重度均存在显著性差异。

表1　34株潜在生防菌对黄瓜霜霉病菌的温室防治效果

注：同列数据后不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著(LSD法测验)。

2.2生防菌株对黄瓜的温室促生作用温室条件下，生防菌处理30 d后，多个处理的黄瓜苗在株高、叶面积、鲜重和干重等指标上与对照之间具有显著性差异(表2)。其中，有7个菌株对黄瓜苗生物量的增加量超过20%，分别是DS22、2BS5、THGB3、THGB4、TDJN4、TDYN1和TDYN3。

2.3生防菌株对黄瓜霜霉病的大田防效挑选在温室条件

表2　34株潜在生防菌对黄瓜的温室促生效果

注：数值为平均值±标准误；同列数据后不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著(LSD法测验)。

下防效和促生效果较好的3个菌株进行大田试验，分别是DS22、TDJN4和THGB4。在生防菌剂初次喷雾后第7、17和27天，所有生防菌处理的病害严重度均低于清水对照(表3)。在生防菌剂初次喷雾后第17和27天，各生防菌处理病害严重度与清水对照相比均存在显著性差异。在第7天时，TDJN4的防效达到62.42%；在第17天时，DS22、TDJN1和TDJN4的防效均超过50%；在第27天时，只有TDJN4的防效超过50%。3次统计调查结果中，只有TDJN4的防效均超过50%。

表3　3株潜在生防菌对黄瓜霜霉病的大田防治效果

注：数值为平均值±标准误；同列数据后不同字母表示不同处理间在0.05水平差异显著(LSD法测验)。

2.4生防菌株对黄瓜叶片叶绿素含量的影响生防菌株处理黄瓜植株30 d后，测定叶片的叶绿素含量，发现生防菌株处理的黄瓜叶绿素总含量均显著高于清水处理组(图1)。3个生防菌株DS22、TDJN4和THGB4处理的黄瓜叶片叶绿素总含量分别为2.07、2.15和2.00 mg/g。

3讨论

黄瓜作为可四季供应的蔬菜，以其丰富的营养价值和美容价值在我国的“菜篮子”工程中占有重要地位。而黄瓜霜霉病作为黄瓜上的主要病害之一，严重影响黄瓜的产量和品质。培育抗病品种和使用化学药剂是目前防治该病害的主要方法，而对于黄瓜霜霉病生物防治的研究甚少。目前，对霜霉病有良好防效的生物试剂有植物的提取液类[9]、微生物类[10]、植物生长调节剂及生物肥类[11-12]、生物蛋白类[13]。该研究通过温室试验和大田试验对黄瓜霜霉病生防菌株进行筛选，得到了对黄瓜有较好防病促生效果的菌株TDJN4。

由于黄瓜霜霉病病原菌不能离体培养，无法进行生防菌株平板拮抗试验，因而减少了一个分离筛选生防菌株的快速途径，所以温室试验结果就显得特别重要。但温室试验人工接种病原菌发病率较低，所以即使能获得温室防效较好的菌株，也很难保证其在日光大棚中的防效。这也是大多数黄瓜霜霉病生防研究的局限性所在。

该研究尚有许多不理想之处，如进行生防菌对黄瓜叶片叶绿素含量影响的试验中测得的叶绿素含量普遍较低，可能是因为秋冬季大棚有内外两层膜，导致植株无法照射到足够的阳光，对植株的生长有很大影响。另外，天气以及人为因素都对该次大田试验结果造成了一定影响。在下一步的试验中，应加强大棚管理、规范田间农事操作，争取得到更加科学的试验结果，为生防菌在大田条件下的推广应用奠定基础。

参考文献

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