氟磺胺草醚降解酶的定位及其酶学性质的研究

田爽，王晓萍

(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨150025)

氟磺胺草醚，也称虎威、北极星、氟磺草醚、除豆莠，是由英国捷利康公司开发的二苯醚类选择性除草剂，1988年首次出口到我国，1994年开始在国内进行生产，目前已在我国登记197个品次，用量居于世界除草剂的第7位［1－4］。大多数除草剂微生物降解除草剂都属于酶促反应［5］。常见的降解酶主要有如磷酸酶等的水解酶和如漆酶等的氧化还原酶两大类［6］。降解酶在微生物细胞中分布的位置因农药种类的不同而异。近年来国内已有报道一些降解酶属于胞内酶［7－10］和胞外酶［11－13］，也有一些分布在如细胞周质［14－15］和细胞间质中等其他部位［16－17］。微生物不同位置的酶可能都与降解污染物的过程有关［18］。目前在农药酶降解领域研究比较广泛的是菊酯类农药、三氮苯类农药和有机磷类农药等［16，19－21］，对于氟磺胺草醚降解酶的研究及其应用方面尚未见报道。因此，研究氟磺胺草醚降解酶以及利用该酶净化环境中的氟磺胺草醚具有重要的现实价值和应用前景。为此，笔者通过采用紫外分光光度法测定酶活力来对氟磺胺草醚降解菌株F12提取的降解酶进行定位，并对其酶学性质进行了研究，以期为解决氟磺胺草醚使用过程中出现的环境问题提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验菌株。供试菌为哈尔滨师范大学生命科学与技术学院筛选、保存的降解菌株F12(克雷伯氏菌属Klebsiella sp．)。

1．1．2 药剂与试剂。99．0%氟磺胺草醚标准品以及所有试剂均购自黑龙江省哈尔滨市南岗区百特化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

1．1．3 主要仪器。超纯水系统(德国 USF PURELAB PLUS);电子天平(Bsz10s型，Sartorius公司);pH计(PB-21型，Sartorius公司);全自动高压蒸汽灭菌锅(日本Sanyo公司);微量移液器(法国Gilson公司);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9145A，上海凯朗仪器设备厂);超净工作台(新加坡Esco公司);超低温冷冻冰箱(日本Sanyo公司);恒温摇床(HZS-H型，国产);低温冷冻离心机(Allegra 21R型，美国Beckman公司);超声波细胞破碎仪(Serial No．157型，英国公司);恒温水浴锅(RTE-111型，Neslab公司)。

1．2 方法

1．2．1 氟磺胺草醚最佳吸收波长的选择。吸取1．0 ml氟磺胺草醚标准液于比色皿中，选择波长范围为550～690 nm，先每隔50 nm波长测定一次氟磺胺草醚吸光度，确定大致范围，再分别依次每隔10、5和1 nm波长测吸光度以确定氟磺胺草醚的最佳吸收波长。

1．2．2 细胞生长与产酶特性研究。分别在发酵培养1、2、3、4、5、6、7 d时测定发酵过程中氟磺胺草醚降解酶酶活性、菌体的生长情况及pH变化，采用紫外分光光度法测定菌体的生长情况及氟磺胺草醚的降解酶酶活性，以发酵培养时间为横坐标，分别以氟磺胺草醚降解酶酶活性、菌体的生长情况(OD600)和pH为纵坐标绘制曲线。

1．2．3 氟磺胺草醚降解酶的提取及定位。取出4℃冰箱保存的菌种平板，挑取单菌落加入到LB培养基中，培养16～18 h(OD600≈0．3)。将菌株活化后制成菌悬液，以15%的接种量接入50．0 ml新鲜配制的发酵培养基中，35℃恒温振荡发酵培养2 d。取10．0 ml发酵后的菌液7 000 r/min离心10 min，收集上清液和菌体沉淀物。上清液经0．22 μm的微孔滤膜过滤除菌，根据无菌滤液的体积边搅拌边加适量碾细的(NH)2SO4粉末，混匀至100%的饱和度，4℃盐析过夜，离心收集蛋白沉淀。用 0．05 mol/L KH2PO4-NaOH缓冲液(pH 7．0)溶解后，再用缓冲液透析至无亚硫酸离子，合并透析液，即胞外粗酶液。菌体沉淀用缓冲液洗涤3次，再将菌体按1∶3(g/ml)的比例悬于缓冲溶液中，在冰浴中用超声波破碎菌体，然后7 000 r/min离心10 min，收集上清液和沉淀。上清液经微孔滤膜过滤，得胞内粗酶液。离心后的沉淀用缓冲液重悬，得菌体细胞碎片悬浮液。测定降解菌株不同组分的酶活性，确定降解酶的位置。取酶活大者作为发酵粗酶液。

1．2．4 氟磺胺草醚降解酶活力测定。反应体系为3．0 ml，将1．0 ml缓冲溶液、1．0 ml 100 mg/L氟磺胺草醚药液以及1．0 ml粗酶液在35℃恒温水浴锅中预热5 min，将粗酶液加入到缓冲液和药液中，置于35℃恒温水浴中反应60 min，加入0．2 ml 1．00 mol/L HCl溶液终止反应。以添加相同体积的蒸馏水且未添加降解酶液的氟磺胺草醚－缓冲液为对照，每处理3次重复，取其平均值。将终止反应后的溶液滴入比色皿中，在661 nm波长下分别测定反应前后所对应氟磺胺草醚含量的吸光度。在该试验条件下，将1 min使吸光度下降0．001 定义为1 个酶活力单位［12］。

1．2．5 反应时间对降解酶活力的影响。向含有100 mg/L氟磺胺草醚的缓冲溶液［缓冲液为0．05 mol/L KH2PO4-NaOH(pH 7．5)］体系中加入粗酶液，于35℃恒温水浴中进行酶促反应。分别在反应进行 0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50和60 min时终止反应，在不同反应时间下分别设置不添加酶液的处理为对照组，测定酶活力。

1．2．6 酶浓度对降解酶活力的影响。在含有100 mg/L氟磺胺草醚缓冲溶液［缓冲液为0．05 mol/L KH2PO4-NaOH(pH 7．5)］体系中分别加入 0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2 和1．4 ml降解粗酶液，使最终测定酶活体系为3．0 ml。将混合溶液35℃恒温水浴30 min后终止反应，设置未添加粗酶液的处理为对照组，测定酶活力。

1．2．7 pH 对降解酶活力的影响。在 pH 分别为 5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0 和 8．5 的 1．0 ml磷酸盐缓冲溶液中加入1．0 ml氟磺胺草醚溶液，再各加入1．0 ml 35℃预热的粗酶液，35℃恒温水浴30 min时终止反应。在不同的pH下分别设置不添加酶液的处理为对照组，测定酶活力。

1．2．8 温度对降解酶活力的影响。在2．0 ml含有100 mg/L氟磺胺草醚的缓冲溶液［缓冲液为0．05 mol/L KH2PO4-NaOH(pH 7．5)］体系中加入 1．0 ml粗酶液，分别置于 20、25、30、35、40、45 和50 ℃恒温水浴 30 min 后终止反应，在不同反应温度下分别设置不添加酶液的处理为对照组，测定酶活力。

1．2．9 药浓度对降解酶活力的影响。在1．0 ml缓冲溶液(pH7．5)中分别加入1．0 ml降解粗酶液，添加1．0 ml浓度分别为10、50、75、100、150、200 和 300 mg/L 的氟磺胺草醚药液，使最终测定酶活体系为3．0 ml。将混合液于35℃恒温水浴30 min后终止反应，以未添加粗酶液的处理为对照组测定酶活力。

2 结果与分析

2．1 氟磺胺草醚最佳吸收波长的选择 经过测定，吸光值在波长为661 nm时达到最高值(图1)，即氟磺胺草醚最佳吸收波长为661 nm。

2．2 细胞生长与产酶特性 由图2可知，氟磺胺草醚降解酶的酶活性在培养的1～3 d内大幅度增加，在第3天达到最大值［2．653 λ/(U·ml)］。从第3天开始酶活性一直处于降低状态。发酵培养1 d后，降解菌菌体数量迅速增大，在发酵培养的第2～4天菌体数量趋于稳定，在第4～7天菌体数量大量减少，处于衰亡期。在发酵培养的7 d内，培养基的pH一直处于降低的状态，在第2天pH降低幅度最大，最高值出现在培养的第1天，为7．1，最低值出现在第7天，为6．1。

2．3 氟磺胺草醚降解酶的定位 采用紫外分光光度法分别测定氟磺胺草醚总酶液、胞外粗酶液、胞内粗酶液以及细胞碎片悬浮液的酶活性，胞外粗酶液的酶活性远高于胞内粗酶液和细胞碎片悬浮液，达到1．971 λ/(U·ml)，占总酶液的75．895%(图3)，由此推断氟磺胺草醚降解菌株F12合成的降解酶大部分分泌至胞外，即属于胞外酶。

2．4 反应时间对降解酶活力的影响 由图4可知，在35℃、0．05 mol/L缓冲液(pH 7．5)中，氟磺胺草醚的降解酶活性在5～30 min范围内随着时间的增加逐渐增大。当时间超过30 min时，降解酶的活性随时间的增加而减小。因此，氟磺胺草醚降解酶酶活力测定应于30 min时终止反应，即氟磺胺草醚降解酶最适酶促反应终止时间为30 min。

2．5 酶浓度对降解酶活力的影响 由图5可知，在0．2～1．0 ml降解酶酶浓度范围内氟磺胺草醚降解酶酶活力随着酶浓度的增加而大幅增加，在0．2～0．6 ml降解酶酶浓度范围内随酶浓度的增加斜率增加，在0．6～0．8 ml降解酶酶浓度范围内斜率有所下降，在0．8～1．0 ml范围内增加趋势趋于平缓，在酶浓度为1．0 ml时降解酶酶活性达到最大值，为1．937 λ/(U·ml)。在酶浓度超过 1．0 ml时，降解酶酶活性随着酶浓度的增加而大幅减小，这可能是由于较高浓度的粗酶液中含有能够抑制氟磺胺草醚降解的物质，导致降解酶活性有所下降的缘故。由此可以确定氟磺胺草醚降解酶最适的酶促反应酶浓度为1．0 ml。

2．6 pH对降解酶活力的影响 由图6可知，在pH为5．5～7．5的范围内氟磺胺草醚降解酶酶活力随pH增加呈逐渐上升趋势，在pH为7．5时降解酶酶活力达到最大值，为1．882 λ/(U·ml)。在 pH 范围为7．5 ～8．5 时降解酶酶活力逐渐下降，且直线斜率大于pH为7．0～7．5的斜率，说明氟磺胺草醚降解酶在中性偏碱性条件下表现出较高的酶活力。由此可以推断氟磺胺草醚降解酶最适酶促反应pH为7．5。

2．7 温度对降解酶活力的影响 由图7可知，当温度升至35℃时酶活力达到最高值［1．927 λ/(U·ml)］。升高或降低温度都不利于降解酶酶活性的增加，究其原因可能是菌体在过高或过低温度下菌体生长缓慢，不利于菌体产酶。由此可以确定氟磺胺草醚降解酶最适酶促反应温度为35℃。

2．8 药浓度对降解酶活力的影响 由图8可知，在药浓度为150 mg/L时降解酶酶活性达到最大值，为1．844 λ/(U·ml)。过高或过低的药液浓度都不利于菌株的酶活性增加，究其原因可能是较高或较低浓度的氟磺胺草醚药液抑制了氟磺胺草醚的降解，导致降解酶酶活性的下降。由此可以确定氟磺胺草醚降解酶最适反应药浓度为150 mg/L。

3 结论与讨论

采用紫外分光光度法测定酶活力，对氟磺胺草醚降解菌株F12降解酶粗酶液的提取的酶进行定位，经鉴定其降解酶属于胞外酶，并对其酶学性质进行了研究。结果表明，该菌株最适的酶促反应条件:时间为30 min，酶浓度为1．0 ml，pH为7．5，温度为35℃，药浓度为150 mg/L。

大多数微生物降解农药的反应属于酶促反应，降解酶在细胞中的位置对于不同的农药来说是不同的，如果降解酶属于胞外酶，则无菌体的富集培养基可以高效降解农药;如果降解酶属于胞内酶，则胞内粗提液对农药有较高的降解性;如果降解酶属于胞壁酶，则细胞碎片悬浮液对农药的降解性较高［10］。酶促反应易受环境条件的影响［22］，该研究对菌株的降解酶进行了定位并探索了最适酶促反应时间、酶浓度、pH、温度以及药浓度，为规模化生产氟磺胺草醚降解酶制剂及治理污染土壤提供了理论依据和技术支持。

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