裙带菜孢子叶多糖的超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究

董秀芳 李 楠 韩 冬 冯丁丁 傅 卉 焦 阳 熊 欣 启 航（.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 6034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 6034）

裙带菜（Undaria pinnatifida）归属褐藻门，褐藻纲，海带目，翅藻科，是一年生大型温带性的海洋藻类，主要分布在中国、日本和韩国的沿海地带［1］，是中国重要的经济型藻类之一，也是中国重要的出口水产品之一。2013年中国裙带菜的产量达17.0万t（干重）［2］，主要分布在辽宁、山东两省。孢子叶作为裙带菜根部，因其纤维含量较高，相对较硬，在加工中往往以废料的形式扔弃［3］，造成了一定的资源浪费和环境污染。孢子叶富含蛋白质、多糖、维生素等营养成分［4］，其多糖又具有降血糖、降血脂、降血压、抗凝血、抗病毒、抗肿瘤等生理功效［5］。因此采用合适的提取方法提取裙带菜孢子叶中的多糖具有非常重要的意义。

目前，天然多糖的提取方法主要有热水浸提法、酶辅助提取法、微波辅助提取法及超声波辅助提取法等［6］。近几年，裙带菜孢子叶多糖的提取方法集中在热水浸提法和酶辅助提取法［7－9］。热水浸提法提取时间长、能耗高；而酶辅助提取法反应条件比较温和，但成本较高。而超声波辅助提取法是利用超声波产生的能量使介质的结构发生空间变化，使有效成分能快速进入溶剂中。同时，超声波产生的空化效应还可进一步破坏细胞结构，进而促进细胞内的有效成分直接溶于溶剂并充分混合，最终实现较高的提取效率［10，11］。因此，本研究拟利用超声波技术来辅助提取裙带菜孢子叶中的多糖，并采用响应面法（response surface method，RSM）设计对提取工艺进行优化，同时利用电子自旋共振技术检测裙带菜孢子叶多糖的抗氧化活性，以期为裙带菜孢子叶的精深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裙带菜孢子叶：大连水产养殖集团有限公司；

1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）：优级纯，美国Sigma公司；

二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）：优级纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司；

其他试剂：分析纯，市售。

1.2 仪器设备

超声波细胞破碎机：JY92－ⅡDN型，宁波新芝生物及科技股份有限公司；

电子顺磁波谱仪：A200型，德国布鲁克公司；

紫外可见光分光光度计：UV－5200型，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

裙带菜孢子叶→干燥（60℃）→粉碎（过60目筛）→加入水浸泡（30min）→超声波处理→恒温提取→离心（4 000r/min，30min）→醇沉（上清液加入3倍体积的无水乙醇）→静置（4℃静置过夜）→离心（4 000r/min，25min）→粗多糖

1.3.2 多糖含量的测定 参照文献［12］。

1.3.3 孢子叶多糖得率的计算 按式（1）进行。

式中：

R——孢子叶多糖的提取率，%；m1——多糖的质量，mg；

m2——孢子叶干粉的质量，mg。

1.3.4 单因素试验 称取裙带菜孢子叶干粉，分别按照不同的提取时间、液料比、超声功率、超声时间进行处理，以多糖得率为评价指标，确定各因素的最佳取值范围。考虑到节省能源、降低成本，并参考文献［13］，设计提取在50℃条件下进行。各单因素试验的设计：

（1）提取时间：固定液料比60∶1（V∶m），超声功率300W，超声时间4min，提取时间分别取1，2，3，4h。

（2）液料比：固定超声功率200W，超声时间4min，提取时间2h，液料比分别取60∶1，70∶1，80∶1，90∶1，100∶1（V∶m）。

（3）超声功率：固定液料比80∶1（V∶m），超声时间4min，提取时间2h，超声功率分别取100，200，300，400，500W。

（4）超声时间：固定液料比80∶1（V∶m），超声功率300W，提取时间2h，超声时间分别取2，3，4，6，8min。

1.3.5 响应面试验 选取影响孢子叶多糖得率显著的因素，以多糖得率为评价指标，采用中心组合试验Box－Behnken设计方案，优化超声波辅助提取裙带菜孢子叶多糖的工艺条件。

1.3.6 孢子叶多糖的抗氧化活性研究

（1）对 DPPH·的清除作用：200μmol/L的 DPPH 200μL，pH 6.0、100mmol/L的磷酸盐缓冲液200μL，各多糖浓度的样液100μL，迅速混合，避光保存30min后，4 600r/mim离心10min［14］。然后立即将一定量的上清液吸入毛细管，放入谐振腔，进行测定。空白组用双蒸水代替样液，以波谱信号第3个峰高值表示信号的相对强度。

（2）对·OH的清除作用：按照Fenton反应建立·OH发生体系，包括10μL的6mmol/L EDTA－2Na—Fe2＋，8μL的6%H2O2，5μL的1mol/L DMPO，各多糖浓度的样液39μL，加 150mmol/L、pH 7.4 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 补 至100μL，振荡后40℃水浴30min，然后立即吸入毛细管，放入谐振腔，进行测定。空白组中提取液用双蒸水代替，以波谱信号第2个峰高值表示信号的相对强度［15，16］。

式中：

R1——对自由基的清除率，%；

A0——空白组峰高；

A1——加样后峰高。

1.3.7 数据分析 采用Excel 2007版软件进行单因素试验分析，Design－Expert 8.05软件进行响应面试验设计及分析，用SPSS 16.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对多糖得率的影响 由图1可知，随着提取时间的延长，多糖得率呈现增加趋势，但提取2h后，增加趋于平缓。考虑到提高效率等原则，确定提取时间2h为宜。

2.1.2 液料比对多糖得率的影响 由图2可知，随着液料比的增大，多糖得率呈现先增加后减少的趋势，这与李建等［13］的研究结果相似。当液料比为90∶1（V∶m）时，多糖得率达到峰值。因此，选择90∶1（V∶m）为宜。

图1 提取时间对多糖得率的影响Figure 1 Effect of extraction time on polysaccharide yield

图2 液料比对多糖得率的影响Figure 2 Effect of ratio of water to material on polysaccharide yield

2.1.3 超声功率对多糖得率的影响 由图3可知，随着超声功率的增大，多糖得率呈现先增加再较少的趋势。当超声功率为400W时，多糖得率达到峰值。因此，超声功率选择400W为宜。

图3 超声功率对多糖得率的影响Figure 3 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.1.4 超声时间对多糖得率的影响 由图4可知，随着超声时间的延长，多糖得率呈现先增加再减少的趋势。当超声时间为6min时，多糖得率达到峰值。当超声时间超过一定范围时，可能导致生物大分子在超声波为自由基的氧化还原反应提供能量的情况下发生降解［17］。因此，超声时间选择6min为宜。

图4 超声时间对多糖得率的影响Figure 4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharides

2.2 响应面分析法对裙带菜孢子叶多糖提取工艺的优化

2.2.1 响应面试验设计 根据单因素试验结果，结合能耗因素，在50℃浸提2h条件下，选择液料比、超声功率和超声时间3个因素为自变量，多糖得率为响应值Y。并根据Box－Behnken原理设计了三因素三水平，共计16个试验点来确定提取的最佳工艺条件［18］。具体试验方案与结果见表1及表2。

表1 响应面的因素与水平Table 1 Factors and levels of RSM

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experiment design and results of RSM

2.2.2 响应面分析 根据表2的试验结果进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型极显著，建模成功；超声时间B和超声功率C项显著，平方项A2极显著、B2显著；液料比A、交互项和C2不显著。拟失态P值为0.258 4，不显著，表明拟失误差相对于纯误差是不显著的，有益于模型的建立。经回归拟合后，得到式（3）：

对模型进行可信度分析，结果见表4。回归方程的复相关系数R2＝0.966 4，说明此模型与实际试验拟合较好。信噪比为11.556大于4，也说明了模型的可靠性。

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the model

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the model

＊＊表示P＜0.01，差异极显著；＊表示P＜0.05，差异显著。

来源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 显著性模型 3.42 9 0.38 19.15 0.000 9＊＊A 1.13×10－4 1 1.13×10－4 5.68×10－3 0.942 4 B 0.22 1 0.22 11.32 0.015 1 ＊C 0.13 1 0.13 6.43 0.044 3 ＊AB 4.23×10－3 1 4.23×10－3 0.21 0.660 6 AC 3.60×10－3 1 3.60×10－3 0.18 0.684 8 BC 0.011 1 0.011 0.56 0.484 0 A2 2.66 1 2.66 134.05 ＜0.000 1 ＊＊B2 0.29 1 0.29 14.44 0.009 0 ＊＊C2 0.10 1 0.10 5.17 0.063 4残差 0.12 6 0.020拟失态 0.083 3 0.028 2.28 0.258 4纯误差 0.036 3 0.012总误差3.54 15

表4 模型的可信度分析Table 4 The credibility analysis of the model

2.2.3 各因素交互作用对多糖得率的响应面分析 模型中各因素之间相互作用的效应图，见图5～7。3个图均发生了弯曲，可以判断3个单因素与提取率的关系都是非线性的；从等高线的形状可以判断两两交互作用均不显著。

2.2.4 模型验证实验 软件分析后得出的最佳提取条件为液料比89.91∶1（V∶m），超声时间6.56min，超声功率435.06W，多糖提取率预计可达到7.70%。考虑到实际操作的可行性，将工艺条件调整为液料比90∶1（V∶m），超声时间6.5min，超声功率440W，经过3次平行实验，测定多糖得率为7.71%，与理论值相差较小。说明建立的模型能真实地反应液料比、超声时间、超声功率对孢子叶多糖得率的影响，该响应面模型具有可行性。本试验的多糖得率明显高于单纯热水浸提法（4.137%）［7］，说明超声波辅助法有利于裙带菜孢子叶多糖的提取。主要是因为裙带菜孢子叶的细胞壁纤维含量较高，单纯的热水浸提很难将多糖从细胞中释放出来，而超声波对孢子叶细胞的机械破坏作用强烈，利于多糖析出。

2.3 裙带菜孢子叶多糖的抗氧化测定

电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）可测定磁场中的未成对电子［19］，可实现快速有效地检测自由基［20］，具有上样量少、灵敏度高等特点。在天然化合物的抗氧化研究中，应用较为成熟。

图5 液料比与超声时间的交互作用Figure 5 Interaction of ratio of water to material and ultrasonic time

图6 液料比与超声功率的交互作用Figure 6 Interaction of ratio of water to material and ultrasonic power

图7 超声功率与超声时间的交互作用Figure 7 Interaction of ultrasonic power and ultrasonic time

2.3.1 对DPPH·的清除作用 DPPH·作为一种含有不对称价电子的氮族自由基，自由基清除剂促使其单电子配对，削弱ESR的信号强度（特征峰的峰高），进而可通过峰高的变化来表示对DPPH·的清除作用。本试验通过ESR技术来检测不同浓度的裙带菜孢子叶粗多糖溶液对DPPH·的清除作用，结果见图8。由图8可知：裙带菜孢子叶多糖对DPPH·具有一定的清除作用，并且随着多糖浓度的升高，清除作用显著增强（P＜0.05）。当多糖浓度为1mg/mL时，清除率可达（71.14±0.55）%左右，其对DPPH·的半抑制率IC50值为0.24mg/mL。该结果与何传波等［19］报道的海带多糖抗氧化活性IC50相似（0.20mg/mL）。

2.3.2 对·OH的清除作用 不同浓度的裙带菜孢子叶粗多糖溶液对·OH的清除作用的ESR图谱及清除率见图9。DMPO可捕捉Fenton反应体系产生的·OH，形成比较稳定的加合物DMPO—OH，进而提高ESR检测的灵敏度［21］。由图9可知，通过ESR检测到了加合物的特征峰型（峰高为1∶2∶2∶1），随着多糖浓度的增加，ESR图谱的峰高逐渐降低，清除能力显著增强（P＜0.05）。其对·OH的半抑制率IC50为0.28mg/mL，与何传波等［22］报道的结果（IC50为0.238mg/mL）相近。

图8 粗多糖溶液对DPPH·的清除作用Figure 8 The scavenging effect of crude polysaccharide solution on DPPH·

图9 粗多糖溶液对·OH的清除作用Figure 9 The scavenging effect of crude polysaccharide solution on·OH

3 结论

在单因素试验的基础上，通过响应面试验确定了超声波辅助提取裙带菜孢子叶多糖在50℃提取2h时的最优工艺，即液料比90∶1（V∶m），超声时间6.5min，超声功率440W，此时多糖得率为7.71%。ESR试验结果表明裙带菜孢子叶多糖对DPPH·和·OH均有较强的清除作用，有望成为具有抗氧化功能的保健食品。下一步将对该多糖进行分离纯化，以明确其结构，同时将开展体内试验研究。

1 Lee J，Hayashi K，Hashimoto M，et al.Novel antiviral fucoidan from sporophyll ofUndaria pinnatifida（Mekabu）［J］.Chemical＆Pharmaceutical Bulletin，2004，52（9）：1 091～1 094.

2 农业部渔业局.2014年中国渔业统计年鉴［Z］.北京：中国农业出版社，2014：34.

3 Katsube T，Yamasaki Y，Iwamoto M，et al.Hyaluronidase－inhibiting polysaccharide isolated and purified from hot water extract of sporophyll ofUndaria pinnatifida［J］.Food Science and Technology Research，2003，9（1）：25～29.

4 苏秀榕，李太武，丁明进.裙带菜孢子叶营养成分分析［J］.营养学报，1994，16（2）：236～238.

5 Synytsya A，Kim W，Kim S，et al.Structure and antitumour activity of fucoidan isolated from sporophyll of Korean brown seaweedUndaria pinnatifida［J］.Carbohydrate Polymers，2010，81（1）：41～48.

6 洪胜，潘利华，罗建平.生物多糖超声波辅助提取研究进展［J］.食品工业科技，2011，32（8）：481～484.

7 朱良，张青，朱钦昌，等.正交设计优化裙带菜孢子叶多糖提取工艺［J］.中国海洋药物杂志，2006，25（6）：42～45.

8 余洋定，启航，李冬梅，等.果胶酶辅助提取裙带菜孢子叶多糖的工艺条件优化［J］.食品与机械，2012，28（1）：175～177.

9 张警予，李裕博，余洋定，等.纤维素酶辅助提取裙带菜孢子叶多糖工艺条件优化的研究［J］.食品科技，2014，39（8）：178～181.

10 李宏睿，范琳琳，徐明生，等.苦瓜多糖超声波辅助提取工艺优化［J］.食品与机械，2010，26（2）：107～125.

11 胡爱军，郑捷.食品工业中的超声提取技术［J］.食品与机械，2004，20（8）：57～60.

12 Qi Hang，Yu Yang－ding，Sun Li－ming，et al.Purification and partial bioactivity in vitro of polysaccharides from sporophyll ofUndaria pinnatifida［J］.Journal of Food，Agriculture ＆Environment，2012，10（3＆4）：197～201.

13 李建，杨波，季宇彬，等.超声波提取裙带菜多糖的工艺研究［J］.食品与药品，2010，12（11）：404～406.

14 赵雅娉，刘山，赵鑫，等.黄海海燕体壁胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性［J］.食品研究与开发，2013，35（1）：5～8.

15 奚倩，赵雅娉，张警予，等.利用电子自旋共振技术研究海参提取液体外抗氧化活性［J］.食品与机械，2014，30（5）：36～40.

16 李裕博，纪晓琳，刘山，等.黄海海燕体壁酶解物抗氧化活性研究［J］.食品与机械，2015，31（1）：137～140.

17 李坚斌，李琳，李冰，等.超声降解多糖研究进展［J］.食品工业科技，2006，27（9）：181～184.

18 Zhong Kai，Wang Qiang.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80（1）：19～25.

19 赵保路.电子自旋共振技术在生物和医学中的应用［M］.合肥：中国科学技术大学出版社，2009：58～59.

20 Falch E，Velasco J，Aursand M，et al.Detection of radical de－velopment by ESR spectroscopy techniques for assessment of oxidative susceptibility of fish oils［J］.European Food Research and Technology.A，2005，221（5）：667～674.

21 Lee S J，Cheong S H，Kim Y S，et al.Antioxidant activity of a novel synthetic hexa－peptide derived from an enzymatic hydrolysate of duck skin by－products［J］.Food and Chemical Toxicology，2013（62）：276～280.

22 何传波，魏好程，熊何健，等.酶与微波处理对海带多糖提取及抗氧化活性的影响［J］.食品科学，2013，34（18）：51～53.