大叶白麻中总黄酮超临界CO2萃取工艺优化

史俊友 景年华 李彩霞（曲靖师范学院，云南 曲靖 655011）

大叶白麻（Poacynum hendersonii），为夹竹桃科白麻属的一种多年生草本植物，与罗布红麻和白麻并称为“罗布麻”［1，2］。其具有延缓衰老、降压、降脂、抗感冒、镇静安神等作用［3－5］，常与罗布红麻一起被用来制作降压药和保健食品。研究表明，大叶白麻叶中含有酚类、鞣质、多糖、黄酮、强心苷、内酯、香豆素、甾体等物质［6］，其中黄酮含量最高且被认为是其主要药效成分，约占大叶白麻叶总质量的5%～6%［7］。目前已确定的黄酮类成分包括异槲皮苷、槲皮素、紫云英苷、三叶豆苷、金丝桃苷、新异芸香甙、异槲皮苷－6′－O－乙酰基、三叶豆苷－6′－O－乙酰基8种物质［8－10］。定量分析表明，异槲皮苷、槲皮素－3－O－槐糖苷和异槲皮苷－6′－O－丙二酸酯为含量最高的3种成分［11］，其中异槲皮苷，又称罗布麻甲素，具有良好的降压效果，是罗布麻药材中具有代表性的活性黄酮类化合物［12］。因此，大叶白麻叶中总黄酮的高效提取对于开发利用大叶白麻资源具有重要的意义。

目前大叶白麻中总黄酮的提取方法有热水提取法、乙醇提取法、丙酮提取法［13］、碱性稀醇提取法、超声提取法［14］等，但国内外尚无利用超临界CO2流体萃取大叶白麻中黄酮的相关报道。超临界CO2萃取具有能耗小、效率高、无污染、条件温和等优点，同时还可通过改变临界温度和压力达到选择性提取、分离、纯化的目的［15－17］，目前在天然产物有效成分的提取中应用越来越广泛。本试验拟以大叶白麻叶为原料，以乙醇作为夹带剂，采用正交设计方法对大叶白麻中总黄酮的超临界萃取（SCDE）工艺进行优化，旨为大叶白麻总黄酮的开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大叶白麻叶：采摘于青海省格尔木市；

二氧化碳：食品级，云南昆明特种气体厂；

芦丁对照品：纯度98%，中国药品生物检定所；

无水乙醇：分析纯，天津光复精细化工公司；

硝酸铝：分析纯，上海艾比化学试剂有限公司；

亚硝酸钠：分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司；

超临界流体萃取仪：HA221－40－10＋2型，江苏南通华安超临界萃取有限公司；

紫外分光光度计：TU1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；

电子天平：MSE323S型，德国赛多利斯公司；

电热鼓风干燥箱：DZF－6050型，北方利辉试验仪器设备有限公司；

中草药粉碎机：FW177型，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理 将采摘的大叶白麻叶用清水洗净后于阴凉处阴干，在烘箱中于70℃条件下烘烤4h，取出，放入中药粉碎机中粉碎，过20目筛备用。

1.2.2 大叶白麻总黄酮的提取 称取已粉碎的大叶白麻样品150g装入萃取装置，将超临界萃取仪调节至预定参数后进行超临界萃取，不断加入选定的夹带剂乙醇，并控制夹带剂流速在6～10mL/min，后改变夹带剂浓度、夹带剂酸碱度、萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂用量等参数，于各不同条件下提取大叶白麻总黄酮［18，19］。

1.2.3 单因素试验设计

（1）夹带剂浓度的确定：因CO2为非极性物质，单纯的超临界CO2流体很难对极性较大的黄酮类物质进行高效萃取［20］。根据预试验的结果，充分考虑试验安全性和经济成本因素，本试验选择乙醇作为夹带剂。在夹带剂pH＝7的条件下，固定夹带剂用量600mL，萃取时间120min，萃取温度45℃，萃取压力20MPa，CO2流量30L/h的条件下，分别选择浓度为50%，60%，70%，80%，90%的乙醇做夹带剂进行萃取试验。

（2）夹带剂酸碱度的确定：选定70%乙醇为夹带剂，在萃取压力20MPa，萃取温度45℃，CO2流量30L/h，夹带剂用量600mL，萃取时间120min的条件下，考察pH值［14］分别为6，7，8，9，10，11时对黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交试验 在确定夹带剂的浓度和酸碱度后，在预试验和文献［17～19］的基础上，本试验以夹带剂的用量、压力、时间、温度等作为影响因素，根据L9（34）的正交表设计正交试验，并进行了四因素三水平的正交试验，以确定最佳工艺，具体设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels list of orthogonal tests

1.2.5 总黄酮含量的测定 根据文献［21］和［22］，修改如下：准确称取经减压干燥至恒重的芦丁对照品10.0mg，置于10mL容量瓶中，加入60%乙醇适量使之完全溶解，用水稀释至刻度并摇匀，即得浓度为1.0mg/mL的芦丁标准品溶液。准确吸取芦丁标准品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置于10mL容量瓶中，分别加30%乙醇至溶液总体积为5.0mL，后加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，再放置6min，加1mol/L氢氧化钠溶液4mL，分别用水稀释至刻度，摇匀，静置15min后分别在510nm处测定不同浓度芦丁标准品的吸光度。采用最小二乘法得线性回归方程：A＝0.032 1c＋0.082 3（r2＝0.999 4）。准确吸取大叶白麻黄酮粗提液1.0mL，加入60%乙醇溶液4mL，后采用与上文相同的显色方法测定大叶白麻叶中总黄酮含量。本试验所涉及样品均平行测试3次，后求平均值。

2 结果与讨论

2.1 夹带剂浓度对大叶白麻总黄酮提取率的影响

由图1可知，夹带剂乙醇的浓度对大叶白麻总黄酮提取率影响显著，随着乙醇浓度的提高，黄酮类化合物提取率不断增加，当乙醇浓度达到70%以后，随着乙醇浓度增大总黄酮得率略有下降，故宜选择70%乙醇作为夹带剂。此结果与王宁［6］、张永秀［13］等采用溶剂提取法所得结果一致，其原因是大叶白麻中黄酮类物质多为黄酮苷［11］，极性较大，故中等极性的溶剂更为适合。当乙醇浓度稍低时，溶剂极性过大，黄酮提取率较低，同时存在萃取釜内样品板结的情况；当乙醇浓度较高时，夹带剂极性较小，不适合大叶白麻总黄酮的提取。故采用浓度70%左右的乙醇提取大叶白麻总黄酮。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Figure 1 The influence of ethanol's different concentrations on the extraction rate of flavonoids

2.2 夹带剂酸碱度对大叶白麻总黄酮提取率的影响

因黄酮中酚羟基显酸性，故黄酮类物质可溶于碱性溶剂，但难溶于酸性溶剂，选择合适的夹带剂pH值对提高黄酮化合物的提取率具有促进作用。由图2可知，适当提高pH值可提高总黄酮提取率，当pH值为10时总黄酮的提取率最高，故后续试验中采用pH值为10的乙醇为夹带剂提取大叶白麻中的总黄酮［19］。

图2 夹带剂酸碱度对总黄酮提取率的影响Figure 2 The influence of ethanol's pH value on the extraction rate of flavonoids

2.3 正交试验结果

由表2可知，各因素中对大叶白麻总黄酮提取率影响最大的为温度，其余因素的大小程度依次为：夹带剂用量＞萃取时间＞萃取压力。提取大叶白麻黄酮类化合物最佳工艺条件为：A1B1C2D3。按照最佳工艺条件进行3次验证实验，测得大叶白麻中总黄酮的平均提取率为5.28%，优于正交设计中的任意一个组合。另外，该方法的提取率高于前人［6，13，14］所采用的各种溶剂提取法，详见表3。

表2 正交试验结果及数据分析Table 2 Results of orthogonal tests and data analysis

表3 大叶白麻总黄酮不同提取方法比较Table 3 The comparation of different extraction methods for total flavonoids fromPoacynum hendersonii

3 结论

本试验采用超临界CO2流体萃取技术对大叶白麻中总黄酮的提取工艺进行了优化，确定了超临界CO2流体法萃取大叶白麻总黄酮的最佳工艺条件：夹带剂为70%乙醇，在pH值为10的情况下，提取所需温度为45℃、压力为20MPa、提取时间为2h。在此条件下，大叶白麻总黄酮平均提取率为5.28%。与常规溶剂回流提取法相比，其操作简单、提取率高、活性成分保存好、品质高，是一种很好的大叶白麻总黄酮分离技术。夹带剂的使用虽然提高了萃取率，但同时也导致了样品的溶胀甚至板结的问题，且在使用过程中夹带剂含水量不宜过高，建议在50%以下。

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