CdTe量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗

张金艳，熊 艳，廖且根，李伟红，王冬根，张 莉，罗林广*

（江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，农产品质量安全重点实验室，农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室（南昌），江西 南昌 330200）

CdTe量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗

张金艳，熊 艳，廖且根，李伟红，王冬根，张 莉，罗林广*

（江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，农产品质量安全重点实验室，农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室（南昌），江西 南昌 330200）

以巯基乙酸作为稳定剂，利用水热反应制备了水溶性的高荧光CdTe量子点，量子产率为54.961%。研究了该量子点在1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的作用下与抗克伦特罗抗体的共价连接。结果表明：该量子点与克伦特罗抗体连接后体系的荧光强度和吸光度均增强，且峰位均未发生明显移动，F/P值为4.20。将该偶联反应物CdTe-Anti CLE pAb作为荧光标记物，组装出一种用于检测克伦特罗的荧光免疫试纸条，最低检测限达0.5 μg/L，与酶联免疫吸附法进行对比，该试纸条能够实现对克伦特罗的快速检测。

水热合成；CdTe量子点；克伦特罗；免疫层析试纸条

克伦特罗（clenbuterol，CLE）是一种β-肾上腺素受体激动剂，在畜牧生产中大剂量使用可明显提高瘦肉率[1]，俗称为“瘦肉精”。人食用残留有CLE的肉制品后，其不良反应主要有：全身乏力、头痛、心悸、心跳加速、手指震颤。此外，还可引起代谢紊乱、血钾降低。长期食用会对心血管造成不良影响，诱发恶性肿瘤，引起死亡[2-3]。因此，各国政府都禁止CLE用作肉用动物的饲料添加剂，我国农业部也明文禁止在饲料中添加CLE，并规定在动物性食品中不得检出CLE。

胶体金免疫层析试纸条是一种快速、简便、灵敏、直观，已广泛用于食品安全现场初筛检测[4-16]。但以胶体金为标记物的检测方法灵敏度相对偏低，且此类物质物易受光学干扰，要求标记物大量聚集至一定浓度后才能产生可视的信号（如胶体金需要达到107个/mm2，才会形成肉眼可见的红色[17]）。在动物性食品中抗生素和违禁药物残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 μg/L的检测限，食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度往往无法胜任[18-20]，这就限制了传统层析方法在食品安全领域的广泛应用。

基于量子点的激发光谱宽、发射光谱窄、荧光强度高、稳定性强，生物兼容性好等特点，在偶联剂的作用下，可以与抗体相连接，形成特异性的偶合物，特别是用这种偶合物作为标记物，可以显著降低检测方法的检测限[21-25]。本研究采用课题组自制的CdTe量子点标记CLE抗体作为指示物，组装成了一种用于检测CLE的量子点荧光免疫层析试纸条。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

碲粉（Te，分析纯，99.999%）、氯化镉（CdCl2·2.5 H2O）、硼氢化钠（分析纯，96%）、氢氧化钠（分析纯） 中国医药上海化学试剂公司；罗丹明6G（分析纯） 上海纪宁实业有限公司；CLE、沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、特布他林、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗标准品、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、羊抗兔二抗、巯基乙酸 美国Sigma-Aldrich公司；CLE抗体、CLE抗原 广州弗赛生物科技有限公司；CLE检测试剂盒 美国Biocheck公司；实验用水由Milli-Q水处理系统制得。

F-7000型荧光分光光度计、U3900型紫外-可见分光光度计、CR21GIII高速冷冻离心机 日本日立公司；pHS-3C酸度计 上海雷磁公司；GZX-9240MBE电热恒温干燥箱 上海博迅实业有限公司；wi95549冷冻干燥仪 东西仪（北京）科技有限公司；ZF-20C紫外分析仪、XYZ3000点膜仪 美国Bio-Dot公司；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜；黏性PVC底板、吸水纸 上海金标生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CdTe量子点的制备及纯化

CdTe量子点的制备：以巯基乙酸作为稳定剂，利用水热法制备CdTe量子点。具体过程如下：圆底烧瓶中加入0.120 g的CdCl2·2.5 H2O和72.7 μL巯基乙酸共同溶于200 mL高纯水中，用1.00 mol/L的NaOH溶液调节到pH值为12.0左右，通高纯氮气30 min，然后在氮气保护下加入上述新制备的碲氢化钠溶液210 μL，溶液颜色立刻变成黄色，得到CdTe量子点前躯体。将原溶液转移至聚四氟乙烯内衬的水热合成反应釜中，置于140 ℃烘箱加热70 min，得到溶液澄清透明的CdTe量子点溶液。选择激发波长为365 nm，进行荧光光谱的表征。

CdTe量子点的纯化：加入2 倍体积的无水乙醇溶液，于高速冷冻离心机15 000 r/min离心15 min，于冷冻干燥仪得到CdTe固体样品，进行透射电镜和X射线衍射图谱表征。

1.2.2 CdTe量子点的量子产率的计算

参照Taylor等[26]介绍的方法来测试。称取一定量的罗丹明6G溶解在绝对无水乙醇里，配成浓度为1×10-6mol/L的溶液，测试其吸收和发光光谱（激发波长530 nm）；调整纳米晶的浓度，紫外吸收测定在530 nm波长处的吸光度小于0.1，测试该浓度条件下的荧光发射光谱。采用公式（1）计算纳米晶的发光量子产率。

式中：r为参比；x为样品；Q为量子产率；A为530 nm波长处的吸光度；D为发光光谱积分面积；n为溶剂折光率（乙醇折光率为1.361 1，水折光率为1.332 9）。

1.2.3 CdTe量子点与Anti-CLE pAb的偶联

利用EDC和NHS的共价偶联作用下，将CdTe量子点表面的羧基进行活化，然后再与CLE抗体表面的氨基形成酰胺犍，即得CdTe-抗CLE抗体偶联物。具体过程如下：在1.5 mL，0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）中，加入200 μL的巯基乙酸稳定的CdTe量子点溶液（OD530nm= 0.30），50 μL，0.1 mol/L的EDC和50 μL，0.1 mol/L的NHS，室温条件下活化15 min，再加入150 μL，0.1 g/L抗CLE抗体，37 ℃、220 r/min振荡5 h，加入1 g/100 mL牛血清白蛋白。室温手振30 min，15 000 r/min离心15 min，取沉淀，待用。

1.2.4 CdTe量子点与抗CLE抗体的偶联效果的检测

标记好的抗体一般采用F/P的比值来鉴定其性能。F/P值代表荧光素和蛋白质的结合比率。将制备好的荧光抗体用紫外分光光度计分别测定280 nm（蛋白质的特异吸收峰）和530 nm（标记荧光CdTe的特异吸收峰）波长处的吸光度按下列公式计算：一般情况下，用于荧光标记的F/P的比值应该在1～5之间。

1.2.5 试纸条组装

利用XYZ点膜仪将0.1 g/L检测抗原和0.2 g/L的羊抗兔二抗喷在硝酸纤维素膜上，形成检测线（T）和质控线（C），T带和C带间隔5 mm，置于37 ℃恒温箱中固定30 min，将硝酸纤维素膜和吸水板依次粘贴在PVC板上，用试纸条切刀切割成试纸条，干燥后，密封保存。

1.2.6 检测方法及其结果判定

将标记好抗体偶联物CdTe-抗CLE抗体溶液50 μL与 50 μL的待测溶液（超纯水配制，内含不同质量浓度的CLE）混合均匀，同时设置空白对照，将组装好的试纸条分别插入相应的混合液中，反应5 min，放置在紫外分析仪观察结果。每个样本重复测定6 次，结果判定：在C带显现荧光带的前提下，目视T带的荧光强度，与空白对照，荧光越弱，代表待测溶液中含被测物的浓度越高。

1.2.7 试纸检测有效性验证

取猪尿样品6 份，按照0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/L和5.0 μg/L的理论终质量浓度进行检测。每个质量浓度重复测定6 次。

2 结果与分析

2.1 CdTe量子点的结构表征

图1 CdTe量子点的透射电镜图Fig.1 TEM image of CdTe QDs

图2 CdTe量子点的XRD图谱Fig.2 XRD image of CdTe QDs

由图1可以看出，该法合成的CdTe量子点大小较为均匀，粒径约为3.5 nm左右。由图2可知，这3 个峰的位置分别为：25.602、42.160和48.456，分别对应于CdTe立方晶系的（111）、（220）、（311）3 个晶面，为了进行对比，XRD谱图下方标出了体块闪锌矿CdTe（实线）和CdS（虚线），发现这3 个值介于CdTe和CdS之间，但偏向于CdTe晶体，属于闪锌矿立方晶相。同时，CdTe量子点的XRD谱的衍射峰位向CdS晶相偏移，说明在CdTe量子点的生长过程中， TGA中巯基发生水解，部分硫原子参与了Cd离子的配位作用[19]X射线峰的宽化显示出所合成的晶体是非常小的纳米晶体。但由于数量有限，所以不会影响CdTe量子点的质量，有些报道认为，CdS只是存在于纳米晶体的表面，形成了类似于CdTe-CdS核壳结构的包裹晶体，可以在一定程度上提高晶体的量子效率，完善其光谱学性质。参照Taylor等[26]的方法来测试该量子点的量子产率达54.961%，能够满足荧光标记的需要。

2.2 CdTe量子点偶联效果及其光谱分析

图3 CdTe量子点偶联抗体前后的荧光图谱Fig.3 Photoluminescence spectra of CdTe QDs with/without antibody labeling

图4 CdTe量子点偶联抗体前后的吸收光谱Fig.4 Absorption spectrum of CdTe QDs with/without antibody labeling

图3 是激发波长为365 nm，激发和发射狭缝设定为5 nm，扫描速率为1 200 nm/min，对CdTe量子点偶联抗体前后的荧光扫描图谱。图4为CdTe量子点偶联抗体前后的紫外吸收扫描图谱。实验发现，该水热合成法制备的CdTe量子点的最大发射波长为560 nm，吸收峰位为530 nm，经过偶联作用后，CdTe量子点的荧光峰位和吸收峰位均没有发生明显的移动，但荧光强度由原来的3 306增加到3 840，吸光度也出现了增强的现象。其原因是CLE抗体在EDC和NHS共价偶联的作用下，形成了酰胺键，并且形成类似于（CdTe）x（CLE）1-x的核壳结构，这种核壳结构降低了CdTe量子点的表面电荷数减少，从而消除了部分非辐射弛豫途径，使得体系的吸光度和荧光强度逐渐增强。F/P值越高，说明抗体分子结合的CdTe量子点的越多，则标记抗体的灵敏度越高，但是F/P值过高，会增加CdTe量子点标记抗体的负电荷，引起非特异性吸附。因此本实验所制备的荧光免疫试剂F/P值为4.20，可以满足一般标记的要求。实验发现，该荧光免疫试剂的颜色依然是淡黄色，而且没有沉淀浑浊现象出现。于4 ℃环境放置3 周后，最大发射峰和强度未见明显变化。

2.3 检出限测定结果

将CLE标准品用乙醇配制成1 g/L溶液，继续用高纯水稀释，使其终质量浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/L和5.0 μg/L。用组装好的CdTe量子点荧光免疫试纸条对上述各质量浓度进行检测，结果如图5所示，当CLE质量浓度小于0.5 μg/L，呈阴性反应，即试纸条上T线显示黄绿色荧光；CLE质量浓度大于0.5 μg/L，呈阳性反应，即试纸条上的T线消失；此荧光免疫试纸条的检测限为0.5 μg/L，与目前市场广泛应用的CLE胶体金快速检测试纸条相比（其在猪尿样品中的检测限，一般为1～3 μg/L），所以大大降低了检出限。

图5 紫外灯光下观察的CdTe量子点免疫层析试纸条检测结果Fig.5 Image of CLE rapid test strip under ultraviolet illumination

2.4 交叉反应性反应结果

用乙醇稀释沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、特布他林、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗标准品1 g/L，在用高纯水稀释，使其终质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/L和5.0 μg/L，用上述试纸条进行检测，每个质量浓度重复6 次，判断试纸条的交叉反应性。实验结果未发现有交叉反应，表明试纸条特异性较好。

2.5 有效性的验证

表1 猪尿样品种不同添加量的ELISA和荧光免疫试纸条测定结果的比较Table1 Comparison of detection results of pork sample by ELISA and strips methods

利用CdTe量子点荧光免疫试纸条和ELISA试剂盒对添加的CLE的猪尿样品进行检测，每个质量浓度检测6 次。结果见表1。CLE添加质量浓度为1 μg/L，试纸条检测为阳性；CLE添加质量浓度低于0.2 μg/L时，试纸条检测结果为阴性。对添加质量浓度为0.5 μg/L的猪尿样品，经ELISA试剂盒测定回收量为（0.47±0.05）μg/L，试纸条检测有5 例阳性，1 例阴性，提出该试纸条的实际检测限高于0.5 μg/L。如规定CLE添加值为2.0 μg/L，则试纸条和ELISA试剂盒的检测结果均符合，表明该试纸条能够满足对猪尿样品中CLE的测定。

3 结 论

本实验利用无机水相合成的CdTe纳米晶，在EDC和NHS共价偶联的作用下，具备了生物活性，通过酰胺键连接了CLE抗体，能够实现对CLE抗原的特异性识别，在最佳的实验条件下，组装了一种灵敏度更高的免疫荧光试纸条，其检测限可达0.5 μg/L（目前市场上广泛引用的胶体金试纸条的检出限为1.0～3.0 μg/L），为瘦肉精市场监督提供了一个新的荧光试纸条。

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Development of CdTe Quantum Dots-Based Lateral-Flow Immunoassay for Rapid Detection of Clenbuterol

ZHANG Jinyan, XIONG Yan, LIAO Qiegen, LI Weihong, WANG Donggen, ZHANG Li, LUO Linguang*
(Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Livestock and Poultry Products (Nanchang), Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Quality and Safety of Agricultural Products, Institute for Quality and Safety and Standards of Agricultural Products, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

CdTe quantum dots (QDs) were synthesized in aqueous solution by using aercapto acetic acid as the stabilizer, and then coupled to the polyclonal antibody (Anti-Clenbuterol pAb, Anti-CLE pAb) with N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC). Spectral analysis further showed that the photoluminescence (PL) intensity and absorbance value of the CdTe-Anti-CLE pAb were enhanced without significant shifts in the characteristic peaks. Using the CdTe-Anti-CLE pAb, an immunochromatographic test strip was developed for the rapid detection of clenbuterol (CLE) with a detection limit of 0.5 μg/L. Compared with the results of enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), the lateral fl ow test strip is very useful and effective as a rapid screening method for detection of CLE residues.

hydrothermal synthesis; CdTe quantum dots; clenbuterol; immunochromatographic test strip

O657

A

1002-6630（2015）22-0161-04

10.7506/spkx1002-6630-201522030

2014-11-04

江西省农业科学院创新基金（青年基金）项目（2012CQN007）；2015年度国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP201500801）

张金艳（1982—），女，助理研究员，硕士，研究方向为农产品质量安全检测分析技术。E-mail：zhangjinyana@126.com

*通信作者：罗林广（1964—），男，研究员，博士，研究方向为畜禽产品质量安全风险评估。E-mail：luolinguang@126.com