尾气分析在发酵食品行业中的应用

董克武 黎 路

（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，上海 200233）

发酵食品是利用有益微生物加工制造的一类食品，具有独特的风味和一些特异性营养因子，有些功能性发酵食品因具有某种生理活性物质还可以起到调节机体生理功能的作用［1］。常见的发酵食品有氨基酸、有机酸、酶制剂、酵母、淀粉及淀粉糖、多元醇和特种功能的发酵制品等。发酵食品的生产过程需要利用微生物体的代谢作用，并借助于对代谢过程的控制来获得所需产品，其中包括大量复杂的生化反应和迁移现象，不同种类的微生物利用碳水化合物、蛋白质等原料，采用不同的代谢途径产生各种代谢产物［2］。生物发酵反应代谢过程中的参数变化，如：温度、酸碱性、氧化还原电位、溶解氧、尾气组分等，是发酵过程状态的实时反映。在现代化的食品研究和生产中，为了获得更好的产品和更高的产率，提升市场竞争力，就需要通过在线监测实时跟踪这些发酵过程关键参数的变化，实施调控优化发酵过程［3］。

1 尾气分析的意义

在温度、pH、溶解氧、尾气组分等参数中，尾气组分浓度的变化反映了整个发酵过程中物质的变化情况，尤其对于耗氧和兼性好氧发酵来说，尾气中CO2和O2的变化，反映了发酵过程中微生物的代谢状态和代谢途径，已经被作为衡量发酵水平的重要指标气体［4，5］。通过在线检测CO2和O2的变化，可以计算获得摄氧率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳释放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）、呼吸熵（respiratory quotient，RQ）等呼吸代谢参数。OUR是单位时间、单位体积发酵液中细胞消耗的氧气量，CER是单位时间、单位体积发酵液中细胞释放的二氧化碳量，RQ是CER除以OUR所得的商［6］，这些指标直接反映了细胞的生长代谢状态，对于发酵状态识别、供氧控制优化、流加补料以及故障预判等，都具有指导意义。尤其在工业发酵的放大过程中，大罐和小罐的细胞代谢特性是否一致是放大成功与否的关键，而要达到此目标，细胞代谢相关的宏观生理参数尤为重要，这些参数在工业规模的发酵大罐中与实验小罐一致时，发酵过程的放大就会取得成功［7］。

2 尾气分析的主要方法

目前，发酵尾气的检测方法主要有基于红外和顺磁原理的尾气分析仪［8］和过程气体质谱分析仪［9，10］。尾气分析仪只能检测氧气和二氧化碳的含量，采样密度也不能太大，一台仪器一般仅能同时监测四路发酵尾气。而近年来，过程气体质谱分析技术悄然兴起，并具有很好的应用潜力。与尾气分析仪相比，过程气体质谱分析仪具有分析速度快、检测精度高、可监测通道数多、可同时检测多种气体组分等优势［11］。早在20世纪90年代，就已经有质谱仪应用于啤酒酵母的研究中［9］，对摄氧率进行测定。

过程气体质谱分析仪是基于先进的质谱技术原理，不仅能够进行快速、准确和高灵敏度的检测，还提供了解未知物质结构的途径，在研究反应机理和监测反应过程的应用中发挥重要作用。其基本原理和分析过程是：气体分子进入离子源，经电离形成不同质荷比（m/z）的离子，由于不同离子在磁场或电场的运动轨迹不同，离子在质量分析器中按照质荷比分开，依次到达检测器而得到质谱图，根据离子丰度及丰度比得到样品的分析结果［12］。因此质谱仪的分析速度非常快，可达到ms级，远远高于尾气分析仪的响应速度，在多通道检测应用中具有显著优势。一台质谱仪即可同时监测多台发酵罐，根据发酵尾气检测周期的需要，可以同时监测十几甚至几十个发酵位点（见图1）。对于大规模的工业生产来说，大大降低了设备的购置费用。除此以外，质谱技术能够实现全组分气体分析，除了O2、CO2之外，还可同时提供N2、Ar等无机气体及多种有机气体定性定量结果，为研究发酵食品尾气组分，指导和调控产品生产，提供更全面的数据支持。

图1 质谱仪多通道监测示意图Figure 1 Online multi-stream off-gas analysis with process mass spectrometer

3 尾气分析在发酵食品中的应用

3.1 氨基酸

氨基酸发酵在发酵工业中占有重要地位，其发酵生产菌大多数为需氧菌或兼性厌氧菌，发酵液中的氧是菌体生长与代谢的必需品，因此，对发酵过程中氧的调控极为重要，尾气中O2和CO2的含量可作为实际控制的参考指标［13］。

谷氨酸是目前世界上产量最大的氨基酸，它不仅是日用调味品味精、鸡精的主体，同时也是其他氨基酸制品、多种化学品、医药品、保健食品的重要原料，应用非常广泛［14］。肖杰等［15］在对RQ控制在谷氨酸发酵过程中的应用研究中发现，通过调节操作条件，可改变产酸期的RQ水平，如果将发酵过程中的RQ值控制在较低水平（0.5），TCA循环通量可被控制在合理水平上，谷氨酸脱氢酶的高活力同时也得到保持，在这种较低水平的RQ调控条件下，可以获得较高水平的谷氨酸发酵产酸率和糖转化率。

赖氨酸是人体所必须的8种氨基酸之一，目前采用最多的是液态生物发酵法进行生产，亦属于耗氧发酵，检测氧的含量对发酵工艺优化和放大具有重要意义［16］。在发酵过程中，通过提高初始糖浓度和选育解除反馈抑制的高产菌株两种方式，都可以将发酵单位提高一定水平，但是如果在发酵过程中进行控制，将基质更多地转化为目标产物，提高发酵过程的转化率，不仅提升了效率，发酵成本也进一步降低［17，18］。

3.2 酶制剂

酶制剂由于具有高效、专一和作用条件温和等优点，在食品加工等行业得到越来越广泛的应用。国内外正在使用或开发的酶制剂常用有α－淀粉酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、蛋白酶、脂酶、植酸酶等［19］。

毕赤酵母表达系统是近年迅速发展起来的一种优秀的真核表达系统，在表达异源蛋白上具有诸多优点，广泛应用于酶制剂发酵生产中，在高密度发酵方面具有巨大潜力［20］。毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，在发酵过程中保证氧的供给是提高发酵产量的重要因素，仅靠溶氧往往不能获得足够的供氧信息，尤其在溶氧为零的时候。质谱仪测定OUR可直接反映出供氧状态，既可避免细胞因供氧不足发生代谢异常从而导致产率降低，也可避免过供氧引起的能量消耗以及对细胞可能造成的伤害。另外，毕赤酵母在发酵过程中需要利用甲醇诱导外源蛋白的表达［21］，而甲醇由于其沸点低、易挥发的特点导致其易随尾气带出，质谱仪是通用型检测仪器，可以通过增加特征监测离子实现对尾气中甲醇含量的测定，为毕赤酵母发酵过程控制提供更为丰富的参考数据［22］。

木聚糖酶是一类水解植物材料中半纤维素的内切酶，可用于食品、保健品等。张洁等［23］在以木霉菌作为生产菌株，以麸皮和木屑为培养基，在2L柱式反应器中固态培养木聚糖酶的过程研究中，在线监测尾气中CO2，发现其含量变化与菌体生长和产酶均有密切关系。对尾气中的CO2进行在线检测，获得固态发酵过程中菌体生长和酶生产的动态信息，从而可以进一步建立过程控制模型，为工艺优化提供可靠依据。

3.3 有机酸

有机酸包括乳酸、柠檬酸、葡萄糖酸等，均是常用的食品添加剂。

乳酸具有很强的防腐保鲜功效，不但可以抑菌、延长食品保鲜期，还有调味、保持食品色泽和提高产品质量等作用。王然明等［24］在乳酸发酵工艺控制研究中，应用过程质谱仪分析尾气，对于乳酸发酵过程代谢进行分析，利用质谱仪分析尾气对凝结芽孢杆菌发酵乳酸过程进行微耗氧发酵供氧水平的精确控制，将菌体的摄氧率控制在0.70mmol/（L·h）时，凝结芽孢杆菌发酵乳酸的最佳合成速率可以达到2.78g/（L·h）。该研究还发现，尾气数据也是乳酸发酵终点判断的有力依据，根据实时尾气数据获得生理参数的趋势变化，及时判定发酵终点，并对发酵过程副产物的代谢进行分析，对提升乳酸产品质量控制起到了非常关键的作用。质谱仪提供的尾气数据对于乳酸发酵产量和质量均有提高，并可实现在线控制。

柠檬酸在食品工业上广泛用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，被称为第一食用酸味剂，主要通过黑曲霉利用糖类发酵生成。对其代谢途径分析，发现RQ是关键参数，反映了底物利用情况、胞内代谢网络通量，与柠檬酸的产量明显相关，二氧化碳的释放速率随着柠檬酸合成速率的增加而迅速下降［25］。因此在柠檬酸的合成过程中，通过在线监测尾气数据来指导供氧，以控制二氧化碳的羧化利用，从而提高柠檬酸产量和增加转化率，对于柠檬酸的生产效率和成本控制有重要指导意义［26］。

4 结论与展望

通过监测食品发酵过程的尾气含量，寻找其中的敏感参数，从而获得发酵过程的最佳干预点，对于优化发酵过程、提高产量有着重要的指导意义。随着技术的不断进步，质谱仪为发酵食品过程监测提供了更为丰富的数据［27］。另一方面，随着中国科学仪器行业的快速发展，国产过程气体质谱分析仪也已在生物发酵尾气监测中广泛应用，如：上海舜宇恒平科学仪器有限公司自主研发的SHP8400PMS过程气体质谱分析仪，不仅性能达到了国际先进水平，还针对发酵行业的应用特点完善了系统解决方案。过程气体质谱分析仪由于其快速响应、数据全面的技术优势，在发酵食品在线尾气分析中的应用必将越来越受到关注，为食品发酵工艺优化和过程控制提供可靠的数据支持。

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