大孔树脂纯化管花肉苁蓉毛蕊花糖苷的工艺研究

顾　云，孙虹霞，梁　昱，刘　昕

（中山大学生命科学大学院，广东广州510275）

GU Yun，SUN Hong-xia，LIANG Yu，LIU Xin*

（Grand School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

大孔树脂纯化管花肉苁蓉毛蕊花糖苷的工艺研究

顾云，孙虹霞，梁昱，刘昕*

（中山大学生命科学大学院，广东广州510275）

本研究旨在探索大孔树脂纯化管花肉苁蓉毛蕊花糖苷的方法。通过静态实验筛选纯化毛蕊花糖苷的最佳树脂类型，并从洗脱剂浓度、洗脱时间、洗脱速度三个方面进行优化以得到该树脂动态洗脱毛蕊花糖苷的最佳方法。结果显示：HPD300对毛蕊花糖苷的吸附和解吸能力最强，其纯化毛蕊花糖苷的最优条件为：吸附平衡后经超纯水洗脱30min，之后依次用20%和50%的乙醇洗脱75min和60min，流速为10mL/min。纯化后，毛蕊花糖苷的含量由5.26%提高至68.20%，回收率为68.90%。研究结果表明，采用大孔树脂HPD300纯化管花肉苁蓉毛蕊花糖苷，成本低，回收率和纯度较高，适用于工业化生产。

管花肉苁蓉，毛蕊花糖苷，大孔树脂，纯化

GU Yun，SUN Hong-xia，LIANG Yu，LIU Xin*

（Grand School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

管花肉苁蓉[Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight]是列当科（Orobanchaceae）肉苁蓉属（Cistanche）多年生草本植物，是名贵的补益中草药。以松果菊苷和毛蕊花糖苷为代表的苯乙醇苷类物质是管花肉苁蓉的主要活性成分。研究发现管花肉苁蓉毛蕊花糖苷具有消炎、抗氧化、降低2型糖尿病小鼠血糖血脂等药理功效[1-6]，但是管花肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量偏低。目前，国内外研究者通常采用色谱技术分离纯化以得到纯度和回收率较高的苯乙醇苷（主要指松果菊苷和毛蕊花糖苷）[7-11]，但是该技术工艺复杂，纯化过程需要使用多种有机溶剂，成本昂贵，不适用于工业生产。与此同时，大孔树脂也已经运用于苯乙醇苷的分离纯化[12-15]，技术成熟，成本低，且纯化过程只使用一种有机溶剂，适用于工业化生产；这些研究涉及到苯乙醇苷总苷的富集、松果菊苷的纯化，但是尚未涉及毛蕊花糖苷的纯化，本研究拟采用大孔树脂纯化毛蕊花糖苷粗样，以期得到高纯度的毛蕊花糖苷。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

毛蕊花糖苷样品制备按照本实验室建立的方法进行制备，制备后样品溶液中毛蕊花糖苷的含量为5.26%±0.091%，浓度为7.57±0.21mg/mL，保存于4℃冰箱；乙醇和冰乙酸分析纯；甲醇MERCK，色谱纯；大孔树脂HPD300，D101，AB-8，S-8购自河北沧州宝恩生物有限公司。

中压制备色谱系统BUCHI公司；高效色相色谱系统美国Waters公司；恒温摇床ZMY-2102C上海智诚有限公司；真空旋转蒸发仪LABORRTA4001 Heidolph公司。

1.2实验方法

1.2.1松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量检测松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量按照高效液相色谱法[16]测定：Symmetry C18（5μm）色谱柱，Waters 1525色谱泵，2996紫外检测器；流动相：0.5%乙酸（A），甲醇（B）；梯度洗脱条件：75%～60%A（0～10min），60%A（10～30min）；检测波长：330nm；柱温：30℃。

1.2.2大孔树脂的预处理和含水量测定为了除去树脂中残留的交联剂和致孔剂等有机溶剂，参照Lin等[17]的方法及产品的使用说明书进行大孔树脂的预处理：首先用无水乙醇浸泡24h，使树脂充分溶胀；之后用去离子水洗涤至无乙醇残留。将处理过的树脂摇匀，吸干表面水分，每种树脂精确称取3份，记质量为W1；80℃烘干至恒重，称重，记质量为W2，按照公式（1）计算含水量（%）。

1.2.3静态吸附和解吸实验称取一定量预处理过的树脂（相当于1.0g干重）于三角瓶中，加50mL样品溶液，120r/min室温振荡24h，过滤，测定滤液中毛蕊花糖苷的含量，根据公式（2）计算饱和吸附量。将吸附饱和的树脂用去离子水洗涤，加50mL 95%的乙醇，120r/min室温振荡24h，过滤，测定滤液中毛蕊花糖苷的含量，根据公式（3）和（4）计算解吸量和解吸率。

其中，C0（mg/mL）和Ce（mg/mL）分别是初始以及吸附平衡后溶液中毛蕊花糖苷的浓度，Vi（mL）是初始样品体积，W（g）是树脂质量，Cd（mg/mL）是解吸溶液中毛蕊花糖苷的浓度，Vd是解吸溶液的体积（mL）。

根据静态实验选择最佳树脂型号，作为后续实验使用树脂。

1.2.4预处理后HPD300的有机溶剂残留物检测目前常见的大孔树脂预处理大都以“加数倍水于乙醇溶液中不显混浊”或“至200～400nm无紫外吸收峰”为合格标准[18]，贾存勤与邓亮等[18-19]发现，对预处理后的大孔树脂进行全波长扫描，若吸光值小于0.2，则气相色谱法检测不出苯、二甲苯等有机溶剂的残留。以后者为标准，在预处理后的大孔吸附树脂中加入无水乙醇（高出树脂5cm），置于恒温振荡器上充分振荡，过滤，滤液进行全波长扫描（200～800nm），检测预处理后树脂的有机溶剂的残留情况。

1.2.5静态吸附动力学称取一定量预处理过的树脂（相当于1.0g干重）于三角瓶中，加50mL样品溶液，120r/min室温振荡16h。每隔1h测定溶液中毛蕊花糖苷的含量并计算吸附能力。以吸附能力为纵坐标，时间为横坐标，绘制静态吸附动力学曲线。

拟合准一级动力学和准二级动力学模型，以更好地了解吸附过程并确定树脂的吸附类型[20-23]。

两种模型的公式分别为（5）和（6）：其中，k1和k2分别是准一级动力学模型和准二级动力学模型的速度常数，qe是理论平衡吸附值，qt是不同时间的吸附值，t是吸附时间。

1.2.6吸附等温线称取8份一定量预处理过的树脂（相当于1.0g干重）于8个三角瓶中，分别添加50mL 8种不同浓度的样品溶液，120r/min振荡24h，温度分别为25、35、45℃。记录初始浓度和吸附平衡时的浓度。参照公式分别对Langmuir（7）和Freundlich（8）吸附模型进行评估，

其中，Qe（mg/g）是平衡吸附量，qm（mg/g）是理论计算出来的最大吸附能力，Ce（mg/mL）是平衡浓度，KL是Langmuir常数，KF和1/n是Freundlich常数。

1.2.7动态吸附和解吸实验称取一定质量预处理的大孔树脂HPD300，湿法装柱，上样，吸附平衡后用超纯水洗脱，之后用不同浓度的乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）进行连续洗脱，洗脱时间均为30min，洗脱速度为10mL/min，制作解吸曲线以确定洗脱杂质和毛蕊花糖苷的乙醇浓度；分别以5、10、15mL/min的速度及确定浓度的乙醇进行不同时间的洗脱，以此确定最佳洗脱速度和洗脱时间。按照式（9）和式（10）计算纯化后毛蕊花糖苷的纯度和回收率。

其中，W1和W2指纯化后样品中毛蕊花糖苷的质量和样品的总质量，W3指纯化前样品中毛蕊花糖苷的质量。

1.3数据处理

数据采用SPSS 18.0进行ANOVA单因素方差分析和多重比较分析，数据均表示为平均值±标准偏差，采用Excel 2010作图。

2　结果与分析

2.1大孔树脂含水量

树脂的吸附特性跟树脂的结构和极性等理化性质有着非常密切的关系。按照方法1.2.2进行四种类型大孔树脂的含水量测定，总结其理化性质如表1。

2.2静态吸附和解吸能力

树脂的吸附特性跟树脂的结构和极性等有密切的关系，选择四种理化性质不同的树脂，从中筛选对毛蕊花糖苷吸附和解吸能力最强的树脂。HPD300对毛蕊花糖苷的吸附能力、解吸能力以及解吸率分别为（49.19±1.56）mg/g，（46.97±0.87）mg/g，（95.52±1.63）%（图1），均显著大于AB-8、D101和S-8（p＜0.05）。树脂、待吸附物质和溶剂之间通过范德华力或者氢键相互作用[24]，从而影响吸附作用，根据“相似相容”原理[25]，相对于强极性的S-8和非极性的D101，弱极性的HPD300和AB-8对于极性相对较低的毛蕊花糖苷具有较强的吸附和解吸能力。而HPD300优于AB-8，可能是由于HPD300在比表面积方面的优势。因此，选择树脂HPD300做后续实验。

表1　实验树脂的理化性质Table.1　Physical properties of the tested macroporous resins

图1　不同型号树脂对毛蕊花糖苷的吸附/解吸能力和解吸率Fig.1　Adsorption/desorption capacities and desorption ratios of acteoside on different resins

2.3预处理后HPD300有机溶剂残留的检测

新购买的大孔树脂可能会有反应不完全的交联剂、致孔剂、分散剂等残留在树脂空穴内，直接使用会危害人体健康[26-27]，因此在使用前必须要进行预处理并检测处理后有机溶剂的残留量是否达到国家食品药品监督管理局的要求。对预处理后HPD300有机溶剂残留进行检测，全波长扫描结果见图2，在200～800nm之间吸光值均未超过0.2，可以说明预处理后的HPD300的有机溶剂残留量符合国家食品药品监督管理局的要求，可以正常使用。

图2　预处理后HPD300的紫外光谱扫描图（200～800nm）Fig.2　Ultraviolet spectrum scan（200～800nm）of pretreated HPD300

2.4静态吸附动力学

按照方法1.2.5进行HPD300静态吸附动力学实验，得到吸附动力学曲线（图3），HPD300对毛蕊花糖苷的吸附量随着时间的增加而增加，在1h达到对毛蕊花糖苷的一个吸附峰值（52.93±1.20）mg/g，在3h时达到最大吸附值（59.29±1.42）mg/g，之后对毛蕊花糖苷的吸附量没有显著增加。

图3　HPD300静态吸附动力学曲线Fig.3　The adsorption kinetics curve of HPD300

拟合动力学模型的参数见表2。两种模型的相关系数均趋近于1（R2＞0.99），说明这两种模型都可以用来描述HPD300对毛蕊花糖苷的吸附作用，但是，准一级动力学模型中的qe更接近于实验值。因此，HPD300对肉苁蓉苯乙醇苷的吸附更符合准一级动力学模型。

表2　准一级动力学模型和准二级动力学模型动力学参数Table.2　Kinetic parameters of pseudo-fisrt order and pseudo-second order model

2.5吸附等温线

为了更好地理解大孔树脂HPD300对毛蕊花糖苷的吸附特点，采用8种不同浓度的样品（毛蕊花糖苷的浓度0.2701～1.8909mg/mL），与HPD300混合后振荡24h，转速为120r/min，温度分别为25、35、45℃，吸附平衡后，计算平衡吸附量，以初始浓度值为横坐标，平衡吸附量为纵坐标，绘制曲线（图4），当C0为0.28～0.97mg/mL时，随着温度的升高，HPD300对毛蕊花糖苷的吸附量无显著增加（p＞0.05），当C0为1.11～1.95mg/mL时，随着温度的升高，HPD300对毛蕊花糖苷的吸附量显著增加（p＜0.05）。

拟合Langmuir和Freundlich方程，参数见表3。可以看出，大孔树脂HPD300对毛蕊花糖苷的吸附更趋近于Freundlich模型，即多分子层不均匀吸附，n值大于1，说明HPD300对毛蕊花糖苷的吸附是有利吸附[28]。

图4　大孔吸附树脂HPD300对毛蕊花糖苷的吸附等温线Fig.4　Adsorption isotherms of acteoside on HPD300

表3　大孔吸附树脂HPD300对毛蕊花糖苷的吸附等温线参数Table.3　Adsorption isotherm parameters of acteoside on HPD300

2.6动态吸附和解吸实验

为了降低流动相乙醇的使用量，并且更有效的完成洗脱过程，考察了不同浓度乙醇对毛蕊花糖苷的洗脱效率（图5）。20%的乙醇开始洗脱出少量的毛蕊花糖苷，洗脱率为1.19%；随着乙醇浓度的升高，对毛蕊花糖苷的洗脱率逐渐增加，到50%时达到最大值，达95.51%。因此，选择20%和50%的乙醇分别进行杂质和毛蕊花糖苷的洗脱。

图5　不同浓度的乙醇对毛蕊花糖苷的解吸率Fig.5　Desorption rates of acteoside by ethanol with different concentrations

吸附平衡后，先用超纯水洗脱，之后依次用20%和50%的乙醇进行杂质和毛蕊花糖苷的洗脱，洗脱速度分别为5、10、15mL/min，洗脱曲线如图6和图7。

图6　20%乙醇对毛蕊花糖苷的解吸曲线Fig.6　Desorption curves of acteoside by 20%ethanol

表4　不同流速洗脱杂质所需时间和乙醇Table.4　The needed time and quantity of ehtanol to elute impurities with different flow rates

表5　不同流速洗脱毛蕊花糖苷的比较Table.5　Compare of eluting acteoside with different flow rates

以毛蕊花糖苷的解吸率不超过2%为标准，确定杂质洗脱时间。速度不同时，洗脱杂质所需时间和乙醇量见表4，洗脱毛蕊花糖苷所需时间和乙醇量、毛蕊花糖苷的回收率和纯度见表5。当流速为15mL/min时，回收率和纯度降低，可能是因为流速太大，超纯水已经洗脱出部分毛蕊花糖苷。因此，采用流速为10mL/min，此时进行杂质和毛蕊花糖苷的乙醇洗脱，乙醇浓度为20%和50%，洗脱时间分别为75min和60min，毛蕊花糖苷的回收率和纯度分别为（68.90±1.02）%和（68.20±2.01）%。

图7　50%乙醇对毛蕊花糖苷的解吸曲线Fig.7　Desorption curves of acteoside by 50%ethanol

3　结论与讨论

本研究通过静态实验筛选出对管花肉苁蓉毛蕊花糖苷吸附和解吸能力最强的树脂HPD300，并建立了HPD300纯化毛蕊花糖苷的方法：吸附平衡后经超纯水洗脱30min，之后依次用20%和50%的乙醇洗脱75min和60min，洗脱速度为10mL/min。

Liu等[12]采用大孔树脂制备管花肉苁蓉苯乙醇苷，将毛蕊花糖苷的含量提高至15.17%，回收率为90.17%；卿德刚等[15]采用大孔树脂纯化管花肉苁蓉松果菊苷，纯度和回收率分别为32.6%和91.4%。本研究经过大孔树脂纯化后，毛蕊花糖苷的回收率和纯度分别为（68.90±1.02）%和（68.20±2.01）%，纯度较高，但是回收率较低，原因可能是回收产物不够细致，放弃了应该保留的部分洗脱液；产物的回收率和纯度均有一定的提升空间，可以从样品的前处理、增加待筛选大孔树脂类型、梯度洗脱等方面进行进一步的探索，以提高毛蕊花糖苷的纯度和回收率。

Li等[7]和Han等[9]采用高速逆流色谱技术进行毛蕊花糖苷的纯化，纯度和回收率均达到90%以上，但是该技术成本高，且纯化过程使用多种有机溶剂，比如乙酸乙酯、正己烷等，均有一定的毒性，不适用于食品和保健品成分的分离纯化；雷厉等[10]和任璐[11]结合柱层析和色谱技术进行毛蕊花糖苷和松果菊苷的纯化，产物的纯度和回收率均达到90%以上，但是纯化过程复杂，需要反复过柱，也需要使用多种有机溶剂，同样不适合分离纯化食品和保健品成分。本研究采用的大孔树脂吸附技术，只使用乙醇一种有机溶剂，该溶剂无毒性，适用于保健品和食品成分的分离纯化；且大孔树脂的成本低，可以重复使用，适用于工业化生产。

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Study on purifying acteoside from Cistanche tubulosa by macroporous resin

The purpose of this paper was to explore method for purifying acteoside from Cistanche tubulosa by using macroporous resin.The most suitable resin was decided by static tests and then three parameters including eluent concentration，eluting time and eluting rate were optimized for developing dynamic eluting conditions.Results showed that resin HPD300 had the best absorption and desorption capabilities.The content of acteoside increased from 5.26%to 68.20%with recovery of 68.90%under the optimized dynamic eluting conditions——eluting with ultrapure water for 30min after saturation adsorption，then with 20%and 50%ethanol for respectively 75min and 60min with flow rate 10mL/min.The method developed provided a potential approach for industrial production of acteoside from Cistanche tubulosa for its relative high recovery and purity and low cost.

Cistanche tubulosa；acteoside；macroporous resin；purify

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0269-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.050

2014－07－31

顾云（1990-），女，硕士研究生，研究方向：微生物药物工程与生物技术。

刘昕（1957-），男，硕士，教授，研究方向：生物技术。