制备型反相高效液相色谱分离猪股骨降血压肽的研究

舒一梅，李　诚，李凌希，郭　威，陈　娜，郑丽君，肖　岚，曾　珍

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

制备型反相高效液相色谱分离猪股骨降血压肽的研究

舒一梅，李诚*，李凌希，郭威，陈娜，郑丽君，肖岚，曾珍

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析、离子交换层析分离后，为了得到高活性且纯度较高的降血压肽单体，采用制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）对离子交换层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱条件的优化，确定了最佳分离条件：0～5min 0%～80%A；5～8min 80%～100%A；8～15min 80%～60%A；15～20min 60%～20%A。结果显示：第一步RP-HPLC分离得到三个组分，其中峰Z2的活性最高，其IC50值为0.0437mg/mL；组分Z2进行第二步RP-HPLC分离，其峰Z21的IC50值达到0.0352mg/mL，其纯度达到96.7%。通过分析Z21的氨基酸组成以及LC-MS的分离鉴定，确定其含有6种氨基酸（Glu、Ala、Val、Leu、Phe、Pro），其分子量为764.8。

猪股骨酶解液，降血压肽，反相高效液相色谱，液质联用，ACE半抑制浓度

猪股骨经酶解后得到的酶解液成分复杂，要得到高活性的猪股骨降血压肽需经多次的分离纯化。多肽的分离、纯化和鉴定中应用较多的是反相高效液相色谱（RP-HPLC），RP-HPLC分辨率和回收率高、重复性好、操作简单，色谱过程稳定[1]。在寻找多肽类物质分离的最佳条件上，有不少学者做了大量的工作，如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容[2]，如潘道东等[3]、Yamamoto等[4]、吴亚丽等[5]利用RP-HPLC分离出了不同序列的降血压肽。

猪股骨酶解液在经过超滤、凝胶层析、离子交换层析之后，具有较高ACE抑制活性的多肽被分离出来，但仍然未能分离至单体，为了进一步研究猪股骨降血压肽的结构与性质，采用制备型RP-HPLC（反相高效液相色谱）进行分离，以期纯化出猪股骨降血压肽单体，为促使降血压肽产品或药物的开发提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

猪股骨骨粉降血压肽粗提物[6]猪股骨酶解后经超滤、凝胶层析、离子交换层析分离而得到，实验室自制；ACE、HHL美国Sigma公司；乙腈、三氟乙酸色谱纯；蛋白含量检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司；其他均为国产分析纯试剂。

QT-2漩涡混匀器上海琪特分析仪器有限公司；紫外分光光度计UV-3200MAPADA；冷冻干燥机、高速冷冻离心机、移液枪Thermo Fisher；超纯水装置优普公司；pH计方舟科技；制备型高效液相色谱（配有BUCHI Photometer C-640紫外检测器）BUCHI；高效液相色谱IC-2010（配有可变波长紫外检测和LC-solution色谱工作站）日本岛津；Agilent 6100 LC-MS安捷伦；氨基酸成分分析仪日本日立公司。

1.2实验方法

1.2.1制备型RP-HPLC分离以猪股骨降血压肽粗提物为原料，通过改变洗脱条件对制备型RP-HPLC分离纯化猪股骨降血压肽的条件进行优化，以组分峰的分离度和ACE抑制活性作为评价指标，以获得较佳的分离纯化条件（每一条件进行6次以上平行实验，直到每次平行实验的分离图谱一致）。色谱柱：C18柱（SKR-10，5μm，300A，25mm×250mm）；进样体积：0.5mL；蛋白浓度：10mg/mL；流速：2.5mL/min；柱温：25℃；检测波长：214nm。本实验选用的流动相为：A液（5%乙腈，含0.05%TFA），B液（95%乙腈，含0.05% TFA）。

1.2.1.1第一步制备型RP-HPLC分离利用不同的洗脱条件进行洗脱，可以得到不同的分离效果色谱图，以组分峰的分离度较好的色谱图来选择最佳的洗脱条件。在最佳洗脱条件下，分离得到的各组分冷冻干燥后测定其抑制ACE活性，收集ACE抑制活性最高的组分。

1.2.1.2第二步制备型RP-HPLC分离洗脱条件为第一步RP-HPLC的最佳分离条件。将经第一步RPHPLC分离得到的高活性组分再进行第二步RP-HPLC分离，直到分离出的降血压肽纯度大于95%。将分离出的各组分冷冻干燥后测定其ACE抑制活性，收集活性最高组分冷冻干燥，备用。

1.2.1.3纯度测定将经过制备型RP-HPLC分离出来的ACE抑制活性最高的降血压肽通过分析型RPHPLC进行纯度鉴定[7-9]，色谱柱：C18（Shim-pack VPODS 4.6mm×250mm，5μm）；进样体积：10μL；蛋白浓度：10mg/mL；流速：1mL/min；柱温：25℃，检测波长：214nm。实验选用的流动相为：A液（5%乙腈），B液（95%乙腈）。洗脱条件：0～5min 0%～20%B；5～8min 20%～40%B；8～15min 40%～60%B；15～20min 20%～0%B。

1.2.2氨基酸分析将制备型RP-HPLC分离出来的ACE抑制活性最高的组分冷冻干燥后称取10mg采用酸水解法[10]测定其氨基酸成分，取三组进行平行实验，然后上机测定。

1.2.3LC-MS鉴定将两步RP-HPLC分离得到的ACE抑制活性最高的组分冷冻干燥后，配成一定浓度的样品溶液，上机测定，得质谱分析数据。

离子方式：ESI+；毛细管电压：3000V；锥孔电压：30V；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：250℃；质量范围：100～2000m/z；光电倍增器电压：700V；分析柱：AtlantisC-182 4.6mm×150mm；流动相：A液（5%乙腈），B液（95%乙腈）。洗脱条件：0～5min 0%～20%B；5～8min 20%～40%B；8～15min 40%～60%B；15～20min 20%～0%B。柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：214nm。

1.2.4指标的测定

1.2.4.1ACE抑制率的测定ACE抑制率的测定主要采用经典的紫外分光光度法测定[11-12]。具体操作如表1，ACE抑制率计算见式（1）。

表1　ACE抑制活性测定方法Table.1　The determination methods of ACE inhibitory activity

式中：Aa：样a的吸光度，样a加入了样品液，与ACE、HHL共同反应的测定值；Ab：样b的吸光度，样b为反应中未加入样品液，反应结束后添加样品液以维持整个反应体系平衡，是ACE与HHL完全反应的参照的测定值；Ac：样c的吸光度，样c在反应前先使ACE失活，再加入样品液，是ACE与HHL反应的空白对照的测定值。

1.2.4.2IC50值测定方法将样品配制成不同的浓度（实验点≥5），分别测定其ACE抑制率，以样品浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标，绘制圆滑曲线，用对数几率图解法计算出IC50值。

1.2.4.3蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定主要采用Lowry法蛋白含量检测试剂盒测定。

2　结果与分析

2.1制备型RP-HPLC分离降血压肽

采用连续两步制备型反相高效液相色谱分离猪股骨降血压肽，第一次分离结果如图1所示，分离出三个峰Z1、Z2、Z3。最佳的洗脱条件为：0～5min 0%～80%A；5～8min 80%～100%A；8～15min 80%～60%A；15～20min 60%～20%A。按Z1、Z2、Z3部分进行收集，冷冻干燥后测定各组分的ACE的抑制活性，结果如表2所示，3个收集组分中Z2活性最高。因此，对Z2组分进行第二步分离，结果如图2所示，将Z2分成了2个主要组分Z21、Z22，分别收集，冷冻干燥后测定其对ACE的抑制活性结果见表3，2个收集组分中Z21ACE抑制活性最高。

图1　第一步RP-HPLC分离图Fig.1　The Chromatogram of the fiactions separated by the first HPLC step

表2　第一步RP-HPLC各组分IC50值Table.2　The IC50of the fiactions separated by the first HPLC step

图2　第二步RP-HPLC分离色谱图Fig.2　The Chromatogram of the fiactions separated by the first second RP-HPLC step

表3　第二步RP-HPLC各组分IC50值Table.3　The IC50of the fiactions separated by the second RP-HPLC step

2.2纯度鉴定

采用分析型RP-HPLC分析Z21的纯度，如图3所示。通过统计分析，其纯度为96.7%。

图3　Z21纯度鉴定色谱图Fig.3　The RP-HPLC Chromatogram of fiaction Z21

2.3氨基酸成分分析

经两步RP-HPLC分离后，收集的Z21成分其氨基酸成分分析如表4所示。

表4　Z21的氨基酸成分及含量Table.4　The content of hydrolytic amino acids in Z21

从表4可看出，分离出的ACE抑制高活性成分Z21含有6种氨基酸，分别为Glu、Ala、Val、Leu、Phe、Pro，说明Z21含有丰富的疏水性氨基酸。

2.4LC-MS鉴定

将分离出的组分Z21通过LC-MS分离鉴定。ESI质谱对肽和蛋白质的分析一般以正离子质谱方式进行。Z21的正离子质谱图如图4所示。

图4　Z21质谱图Fig.4　Mass spectrum of Z21performed by mass spectrometry analysis

用质谱法测定肽的序列是根据其质谱中碎片离子来推导的。质谱中出现的碎片序列信息主要通过酰胺键（肽键）的断裂来形成。图4中分子离子峰（M+ H）+所对应的是765.8。因此，Z21的分子量为764.8。

大量学者的研究认为，ACE抑制肽的抑制活性主要取决于C末端的氨基酸，C末端氨基酸为芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）和脯氨酸时其抑制活性较高。此外，N末端为疏水性的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸的肽与ACE的亲和力较强，抑制活性较高[13]。Z21中含有丰富的疏水性氨基酸，如Pro、Phe、Leu等，与Cheung等[14]的结论一致，是具有高活性的ACE抑制肽。

3　结论与讨论

以猪股骨降血压肽粗提物为原料，采用了RPHPLC法及连续两步RP-HPLC分离猪股骨降血压肽。经两步RP-HPLC分离后，得到Z21活性成分，经分析型RP-HPLC检测，其纯度达到96.7%。通过质谱测定、解析，降血压肽Z21的分子质量为764.8，其IC50值为0.0352mg/mL。

在分离猪股骨降血压肽的过程中，每一个纯化步骤未能分离出高纯度的猪股骨降血压肽单体，因此结合多个分离纯化的单元技术，能够更好的分离出猪股骨降血压肽单体。本实验通过RP-HPLC技术，优化了RP-HPLC的分离条件，分离出的猪股骨降血压肽纯度达到96.7%，说明其具有很高的ACE抑制活性。本实验是通过体外活性的测定进行评价的，在条件许可的情况下，后续应进行动物实验、验证其活性，放大实验，为实现产业化提供参考。

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Isolation and identification of antihypertension peptides from pig femoral collagen with RP-HPLC

SHU Yi-mei，LI Chen*，LI Ling-xi，GUO Wei，CHEN Na，ZHENG Li-jun，XIAO Lan，ZENG Zhen
（College of Food，Sichuan Agriculture University，Ya’an 625014，China）

In order to obtain high activity and purity of antihypertensive peptides，the method of RP-HPLC was used to separate the solution after the preliminary separation and charactenization by ultrafiltration，gel permeation chromatography and ion exchange chromatography.Studying the effect of separation and purification on the factors of elution conditions，the optimal conditions for analysis were as follows：0～5min 0%～80%A；5～8min 80%～100%A；8～15min 80%～60%A；15～20min 60%～20%A.The results showed that the fraction was then purified by frist RP-HPLC into 3 peaks，in which peak Z2had the strongest ACE inhibitory activity with an IC50of 0.0437mg/mL.The peak Z2was desalinationted by the second RP-HPLC.The peak Z21had the highest ACE inhibitory activity which with an IC50of 0.0352mg/mL，the purity was 96.7%.Through the analysis of the amino acid of Z21and identification of LC-MS，it contained six kinds of amino acids（Glu，Ala，Val，Leu，Phe，Pro），the molecular weight was 764.8.

enzymolysis liquid of the pig femoral；antihypertensive peptides；RP-HPLC；LC-MS；the half inhibitory concentration of ACE

TS251

B

1002-0306（2015）04-0265-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.049

2014－07－31

舒一梅（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：畜产品质量与安全。

李诚（1964-），男，教授，研究方向：畜产品加工与质量安全控制。