细菌纤维素产生菌选育与突变株发酵特性的研究

邓毛程，李　静，王　瑶，陈维新，吴永辉（.广东轻工职业技术学院，广东广州50300；.广州倚德生物科技有限公司，广东广州5340）

细菌纤维素产生菌选育与突变株发酵特性的研究

邓毛程1，李静1，王瑶1，陈维新1，吴永辉2
（1.广东轻工职业技术学院，广东广州510300；2.广州倚德生物科技有限公司，广东广州511340）

为了获得细菌纤维素高产菌株，采用紫外线和硫酸二乙酯对实验室保存的木葡糖酸醋杆菌BC13进行复合诱变。通过诱变、筛选和连续传代实验，获得1株产量达15.6g/L的高产突变株Y19-11，该菌株遗传稳定性良好，比原出发菌株产量提高44.4%。同时，通过比较不同温度、不同初始pH下的菌体量和细菌纤维素产量，确定突变株Y19-11的最适温度和初始pH分别为30℃和5.5。

细菌纤维素，紫外线诱变，硫酸二乙酯诱变，发酵特性

细菌纤维素（bacterial cellulose，简称BC）最早由英国科学家Brown发现[1]，是由微生物（主要是细菌）利用液态培养基发酵产生的细胞外纤维素，与植物纤维素一样，都是由葡萄糖基通过β-1，4-糖苷键连接起来的大分子[2]。与植物纤维素相比，细菌纤维素具有高结晶度、高化学纯度、高抗张强度、高弹性模量、吸水性强和生物相容性好等优点，这些优点使其在食品、生物医药、组织工程支架材料、声学器材、化妆品、膜过滤材料、造纸等领域具有巨大的应用潜力[3-5]。

迄今为止，人们已经发现醋酸菌属（Acetobacter）、假 单 胞 菌 属（Prudomonas）、无 色 杆 菌 属（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligcncs）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、固氮菌属（Azotobacter）、气杆菌属（Aerobacter）、根瘤菌属（Rhizobium）和八叠球菌属（Sarcina）等九个属中某些微生物能够合成细菌纤维素，其中，木醋杆菌（Acetobacter xylinum）是目前最常用和产率最高的细菌纤维素生产菌[3，6]。多年来，国内外研究人员一直致力于细菌纤维素高产菌的选育工作[5，7-8]，但现有菌种的细菌纤维素产率依然较低。为了进一步提高细菌纤维素产生菌的产率，本研究对实验室已获得的野生菌株进行复合诱变选育，以期获得高产的突变株，为细菌纤维素的研究和生产提供优良菌种。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）BC13广东轻工职业技术学院食品与生物工程系筛选与保藏的菌种；固体培养基葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，琼脂20g/L，pH5.5，121℃灭菌20min；液体培养基葡萄糖50g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L；新鲜椰子水椰子破壳取水，50%（v/v），pH5.5，121℃灭菌20min。

SHZ-82A恒温水浴振荡器江苏省太仓医疗器械厂；KDC-210HR高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；A200基因扩增仪杭州朗基科学仪器有限公司；RDY-SP1Z核酸电泳仪北京荣阳经典科技有限公司；GI-1凝胶成像系统通宝达成科技（北京）有限公司；S-3000N扫描电镜日本日立公司，VERTEX70傅立叶红外光谱仪德国布鲁克公司。

1.2实验方法

1.2.1菌悬液的制备用适量的无菌生理盐水将斜面上的菌种洗下，置于涡旋振荡器上振荡5min，再用无菌生理盐水调节菌体浓度，使浓度为106～107个/mL。

1.2.2出发株的紫外诱变将出发株BC13的菌悬液放入无菌的培养皿中，置于紫外灯（30W，254nm）下方20cm处进行照射处理，照射期间采用磁力搅拌器进行搅拌，每隔10s取样进行适当稀释，涂布平板培养基，于30℃下避光培养72h，观测菌落数，以未经照射的平板为参照，计算紫外诱变的致死率，选择适宜的诱变剂量。然后，在优选剂量下对菌悬液进行处理，经平板分离、液体发酵筛选，筛选出高产的UV突变株。

1.2.3UV突变株的化学诱变采用硫酸二乙酯进行化学诱变，操作参照文献[9]的方法。在UV突变株的菌悬液中，加入硫酸二乙酯，使其浓度为1%（v/v），于30℃下振荡处理，每隔5min取出1mL的菌悬液，用0.5mL硫代硫酸钠终止反应，再进行适当稀释，涂布平板培养基，于30℃下避光培养72h，观测菌落数，以未经处理的平板为参照，选择适宜的诱变剂量。然后，在优选剂量下对菌悬液进行处理，经平板分离、液体发酵筛选，筛选出高产的硫酸二乙酯突变株。

1.2.4突变株的分离与筛选将优选剂量下处理的菌悬液进行适当稀释，涂布平板培养基，于30℃下避光培养72h，挑取颗粒圆润，外形完整饱满的菌落，接入斜面培养基进行培养24h，然后将斜面菌种接入装有100mL液体培养基的三角瓶，置于30℃、150r/min的条件下振荡培养12h，再静止发酵10d，测定细菌纤维素产量，筛选出高产的突变株。

1.2.5传代稳定性的分析将上述优选突变株的斜面菌种转接斜面10次，每次的斜面培养24h，然后将各次的斜面菌种接入装有100mL液体培养基的三角瓶中，按1.2.4中的方法进行发酵，测定发酵液中细菌纤维素产量，分析突变株的传代稳定性。

1.2.6突变株发酵温度的分析将上述选突变株的斜面菌种接入装有100mL液体培养基的三角瓶中，分别在不同温度下，振荡（150r/min）培养12h，再静止发酵72h，测定发酵液中的菌体量。同时，以相同条件和方式进行发酵，静止发酵10d后，测定发酵液中的细菌纤维素产量。根据测定结果，分析突变株的适宜发酵温度。

1.2.7突变株发酵pH的分析将液体培养基调节至不同pH，按1.2.6中方法，在30℃下进行发酵，分别测定发酵液中的菌体量和细菌纤维素产量，分析适宜的初始发酵pH。

1.2.8指标的测定

1.2.8.1细菌纤维素产量（干重）的测定采用称重法测定发酵液中细菌纤维素产量[10]。将发酵液中的凝胶膜状产物取出，用纯净水漂洗干净，放入0.1mol/L的NaOH溶液中煮沸30min，用蒸馏水漂洗至中性，于105℃的条件下干燥，直至恒重，然后准确称量干燥物的质量，即可计算细菌纤维素产量（干重）。计算公式如下：

1.2.8.2菌体量（干重）的测定改进文献[11]提供的方法，将发酵液pH调节至5.0，加入3g纤维素酶粉（10000U/g），置于40℃下振荡酶解2h，然后离心分离（12000r/min，15min），收集沉淀物，于80℃下干燥，恒重后称量干燥物质量，菌体量的计算公式如下：

菌体干重（g）=离心沉淀物干燥质量（g）-3

1.2.8.3紫外诱变的致死率的计算致死率的计算如下式：

致死率（%）=[（参照平板上的菌落数-诱变平板上的菌落数）/参照平板上的菌落数]×100

2　结果与讨论

2.1紫外线诱变与筛选

紫外线对菌种BC13的致死率曲线如图1所示。随着紫外线照射时间的增大，菌种BC13的致死率呈上升的趋势，照射时间超过60s以后的致死率十分接近100%。根据文献报道[12]，致死率较高时，存活的菌株出现正突变概率较小，但正突变菌株的产量提高幅度有可能很大，因而较多研究者选择致死率在80%～90%之间的剂量为最佳诱变剂量[13-15]。从图1可看出，紫外线照射30s时的致死率为88.2%，故被选为最佳诱变剂量。

图1　紫外线诱变的致死率曲线Fig.1　Motality curve of UV mutagenesis

菌种BC13在此剂量下进行诱变，经平板分离，挑取96株菌株，再经发酵筛选，获得产量提高幅度达10%以上的菌株有8株，它们和出发菌株BC13的细菌纤维素产量如图2所示。由图2可知，这8株菌的产量在11.9～12.7g/L之间，产量增加幅度的范围为10.2%～17.6%，其中突变株Y26的产量最高，达12.7g/L，优于近年来汤卫华[9]、万中义、Mohite等[16-17]的研究成果。

图2　紫外线突变株的细菌纤维素产量Fig.2　Bacterial cellulose（BC）yield data of strains treated by UV mutation

2.2硫酸二乙酯诱变与筛选

利用硫酸二乙酯对8株紫外线突变株进行处理，致死率的数据分布如表1所示。8株菌的致死率随硫酸二乙酯作用时间延长而增大，在30min时的致死率都在80%～90%之间，在40min及以后的致死率均超过90%，故优选30min作为硫酸二乙酯对这8株菌的最佳诱变剂量。

表1　硫酸二乙酯诱变的致死率（%）Table.1　Motality of diethyl sulfate mutagenesis（%）

在最佳诱变剂量下，利用硫酸二乙酯分别对紫外线照射的突变株Y02、Y14、Y19、Y26、Y32、Y37、Y45和Y48进行化学诱变，经平板分离、发酵筛选，选出产量比出发菌株BC13增加30%的菌株15株，它们的产量在14.1～15.6g/L之间，产量增加幅度的范围为30.6%～44.4%，如表2所示。经硫酸二乙酯诱变处理，有一部分产量较高的紫外线突变株发生了负突变，从突变株Y32和Y48的处理液中没有获得正突变幅度较大的菌株，产量最大的突变株Y26的正突变概率也相对减小；在此次诱变处理中，由突变株Y19诱变得到的菌株Y19-11的产量最大，达到15.6g/L，比突变株Y19的产量增加27.9%，比出发菌株BC13的产量增加44.4%。本结果较汤卫华[9]文献报道的细菌纤维素产量9.91g/L有较大幅度提高，因此，将突变株Y19-11优选为进一步研究的对象。

表2　硫酸二乙酯突变株的细菌纤维素产量Table.2　Bacterial cellulose（BC）yield data of strains treated by diethyl sulfate mutagenesis

2.3传代稳定性分析

将突变株Y19-11的斜面菌种进行转接斜面10次，各次斜面菌种的液体发酵结果如图3所示。从图3看出，细菌纤维素产量在14.9～15.8g/L的范围内波动，波动幅度很小，其中8次的产量均在15.4g/L以上，表明突变株Y19-11具有良好的传代稳定性，其高产细菌纤维素的性能可以比较稳定地保持，较出发菌株产量增加37.9%～46.2%。

图3　传代10次的细菌纤维素产量Fig.3　Bacterial cellulose（BC）yield data of strain during 10 times passaged

图4　不同温度下的细菌纤维素产量和菌体重量Fig.4　Bacterial cellulose（BC）yield and cell weight under different temperature

2.4突变株的适宜温度

将突变株Y19-11分别在不同温度下进行液体发酵，静止发酵3d的菌体量和静止发酵10d的细菌纤维素产量如图4所示。可以看出，菌体量和细菌纤维素产量的关系大致为正相关，这与先前文献报道的结论基本一致[18-20]。菌体量和细菌纤维素产量在28～32℃之间处于较大，其中30℃的菌体量和细菌纤维素产量均为最大，分别为1.62g/L和15.6g/L。实验表明，突变株Y19-11的最适发酵温度为30℃。

2.5突变株的适宜初始pH

在不同的初始pH下，突变株Y19-11静止发酵3d的菌体量和静止发酵10d的细菌纤维素产量如图5所示。在初始pH为5.0～6.0的范围内，菌体量和细菌纤维素产量较大，两者在初始pH为5.5时均达到最大。在细菌纤维素产生的同时，会伴随产生酸类代谢产物，发酵液的pH下降幅度较大，不利于菌种生长和发酵，但浅层静态发酵（目前细菌纤维素发酵的主要工艺）过程难以调解pH，因而初始pH的控制十分重要。从图5看出，突变株Y19-11的最适初始pH宜选择为5.5。

图5　不同初始pH下的细菌纤维素产量和菌体量Fig.5　Bacterial cellulose（BC）yield and cell weight under different initial pH value

3　结论

目前，国内外研究人员的研究热点主要还集中在低值碳源、能源的筛选[21-23]，包括各种食品加工废渣、酿造废水等，细菌纤维素产量基本在10g/L以下，对优良菌种开展诱变育种的研究较少，本文以木糖酸醋杆菌BC13为出发菌株，利用紫外线对其进行诱变，筛选获得细菌纤维素产量增加幅度为10%的突变株8株。然后，利用硫酸二乙酯对8株紫外线突变株进行复合诱变，筛选获得产量比菌株BC13增加30%以上的突变株15株。其中，突变株Y19-11的产量最大，其产量达15.6g/L，比菌株BC13的产量增加44.4%。经过10次转接斜面和发酵，突变株Y19-11的发酵产量波动极小，表现了良好的遗传稳定性。分别在不同温度、不同初始pH下进行发酵，通过比较菌体量和细菌纤维素产量，确定突变株Y19-11的最适温度和初始pH分别为30℃和5.5。该菌株具有生产应用的潜力，但仍需对发酵条件进行深入的研究。

[1]Brown A J.On an acetic ferment which forms cellulose[J]. Journal of Chemical Society，1886，49：432-439.

[2]曹海鹏，袁帅，赵昆，等.细菌纤维素高产菌株的筛选及鉴定[J].食品科学，2010，32（5）：211-214.

[3]陆胜民，贾静静，杨颖.细菌纤维素发酵工艺与应用研究进展[J].食品与发酵科技，2011，47（1）：27-31.

[4]Wang Yan，Luo Qingping，Peng Bihui，et al.A novel thermotropic liquid crystalline：Benzoylated bacterial cellulose [J].Carbohydrate Polymers，2008，74（4）：875-879.

[5]王银存，李利军，马英辉，等.细菌纤维素生产及应用研究进展[J].中国酿造，2011，229（4）：20-23.

[6]Peggy O S，Cannon R E.Acetobacter ylinum：An Inq uiry into Cellulose Biosynthesis[J].The Alnerican Biology Teacher，2000，62（6）：442-444.

[7]Bae SQ，Sugano Y，Ohi K，et al.Features of bacterial cellulose synthesis in a mutant generated by disruption of the diguanylate cyclase 1 gene of Acetobacter xylinum BPR2001[J].Applied Microbiology and Bioteehnology，2004，65（3）：315-322.

[8]张雯，齐香君，李彦军，等.醋酸杆菌Acetobacter xylinum pde基因敲除研究[J].陕西科技大学学报，2013（5）：121-125.

[9]汤卫华，李飞，贾原媛，等.细菌纤维素高产菌株的诱变选育和发酵条件研究[J].现代食品科技，2009，25（9）：1016-1019.

[10]邓毛程，吴亚丽，梁世中.超声波促进高纤椰果发酵的研究[J].食品与发酵工业，2008，34（3）：62-64.

[11]汤卫华，马霞，贾原媛，等.木醋杆菌流加静置培养生产细菌纤维素[J].食品与发酵工业，2008，34（2）：21-24.

[12]施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学[M].北京：科学出版社，2003：l33-147.

[13]帖金鑫，林娟，李小平，等.耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育[J].食品研究与开发，2013，34（17）：111-115.

[14]李严军，廖杰琼，青文哲，等.产类黄酮链霉菌的紫外线诱变选育[J].农产品加工·学刊，2013（9b）：1-3.

[15]古丽娜孜，库米拉，张晓燕，等.低温淀粉酶高产菌株的诱变选育[J].新疆农业大学学报，2013，36（4）：288-292.

[16]万中义，吴顺清，朱海云，等.细菌纤维素高产菌株的诱变育种[J].湖北农业科学，2010，49（12）：3067-3068.

[17]B V Mohite，K K Kamalja，S V Patil.Statistical optimization of culture conditions for enhanced bacterial cellulose production by gluconoacetobacter hansenii ncim 2529[J].Cellulose，2012，19（5）：1655-1666.

[18]邵伟，乐超银，熊泽，等.醋酸杆菌合成细菌纤维素的发酵动力学研究[J].中国酿造，2005，151（10）：26-28.

[19]齐香君，张雯，韩戌瑁，等.细菌纤维素生产菌株的动力学研究[J].食品科学，2005，26（12）：65-67.

[20]马霞，察可文，王瑞明，等.细菌纤维素静态发酵生产的动力学模型的确定[J].河南工业大学学报：自然科学版，2005，26（1）：36-38.

[21]Dehui Lin，Patricia Lopez-Sanchez，Rui Li，et al.Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter hansenii CGMCC 3917 using only waste beer yeast as nutrient source[J].Bioresource Technology，2014，151：113-119.

[22]Fa’bio P Gomes，Nuno HCS Silva，Eliane Trovatti，et al. Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter sacchari using dry olive mill residue[J].Biomass and Bioenergy，2013，55：205-211.

[23]Jyh-Ming Wu，Ren-Han Liu.Thin stillage supplementation greatlyenhancesbacterialcelluloseproductionby Gluconacetobacter xylinus[J].Carbohydrate Polymers，2012，90：116-121.

Study on breeding of bacterial cellulose producing strain and fermentation characteristics of mutation strain

DENG Mao-cheng1，LI Jing1，WANG Yao1，CHEN Wei-xin1，WU Yong-hui2
（1.Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；2.Guangzhou Yide Biotechnology Co.，Ltd.，Guangzhou 511340，China）

In order to obtain high bacterial cellulose（BC）-producing strain，composite mutagenesis of ultraviolet and diethyl sulfate was used to Gluconacetobacter xylinus BC13 which preserved in laboratory.A high-yield mutant strain Y19-11，BC yield reached 15.6g/L，was obtained by mutagenesis，screening and continuous passage.The mutant strain had excellent genetic stability and its BC yield increased by 44.4%，higher than the original strain.Meanwhile，through comparing the cell weight and yield of BC under different temperature and initial pH value，the optimal temperature and initial pH of mutant strain Y19-11 were determined as 30℃and 5.5，respectively.

bacterial cellulose；ultraviolet mutagenesis；diethyl sulfate mutagenesis；fermentation characteristics

TS201.2

A

1002-0306（2015）04-0159-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.026

2014－04－24

邓毛程（1971－），男，博士，教授，研究方向：生物工程。

2010年广州市科技计划项目（2010Y1-C571）；2010年广东省科技计划项目（2010B011000008）；2011年广东省教育厅省级工程中心建设项目（GCZX-B1103）。