一种适宜分离纯化虎杖中白藜芦醇的大孔树脂的修饰研究

李祚丹，季金苟，刘　莉，陈园园，何　慧，徐　溢，穆小静

（重庆大学化学化工学院药学系，重庆400044）

一种适宜分离纯化虎杖中白藜芦醇的大孔树脂的修饰研究

李祚丹，季金苟*，刘莉，陈园园，何慧，徐溢，穆小静

（重庆大学化学化工学院药学系，重庆400044）

以制备一种更适宜分离纯化白藜芦醇的大孔吸附树脂为研究目标。在五种大孔吸附树脂中，筛选出了NKA-II大孔吸附树脂，将其氯甲基化后再接枝苯胺，得NKA-II-苯胺，将NKA-II和NKA-II-苯胺树脂对白藜芦醇的吸附和解吸进行对比研究。NKA-II-苯胺树脂对白藜芦醇的吸附和解吸性能有明显的增强，当上样溶液pH=4，白藜芦醇质量浓度为0.10mg·mL-1，吸附时间为300min，以乙醇60%解吸时，其对白藜芦醇的吸附率由87.62%提高到95.85%，解吸率由88.75%提高到92.19%。说明新制备的NKA-II-苯胺树脂更适宜分离纯化白藜芦醇。

虎杖，白藜芦醇，大孔吸附树脂，接枝，分离纯化

白藜芦醇为多年生草本植物虎杖的重要活性物质之一[1-2]，属天然的抗氧化剂，有多种药理活性，如降低血液粘稠度，抑制血小板凝结、血管舒张，保持血液畅通，预防癌症的发生及发展，抗动脉粥样硬化和冠心病等[3]。目前，从虎杖中分离纯化白藜芦醇的方法主要有氧化铝柱层析法、硅胶柱层析法、聚丙烯酸树脂和大孔树脂法等。相比而言，大孔树脂具有比表面积大、吸附容量高、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、节省费用等诸多优点[4-6]，因而是目前的研究热点。本文探索了不同大孔吸附树脂对白藜芦醇的吸附和解吸情况，筛选出最优的大孔吸附树脂，并在其结构上进行接枝修饰，进一步考察了修饰后树脂对白藜芦醇的吸附和解吸性能，以期找到一种更为适宜的大孔吸附树脂，为工业化生产白藜芦醇奠定一定的基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

白藜芦醇标准品纯度：99%，陕西森弗生物技术有限公司，批号：BL121020-1；虎杖茎根重庆科瑞南海制药有限公司；AB-8、NKA-II、NKA-9、D101、H103大孔吸附树脂南开大学化工厂；无水乙醇、盐酸AR，川东化工集团化学试剂厂；氢氧化钠AR，成都市科龙化工试剂厂。

T6型新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；THZ-C型恒温振荡箱江苏太仓市实验设备厂；RE-2000A型旋转蒸发仪 上海嘉鹏科技有限公司；Tecrai 10型扫描电子显微镜荷兰Philips公司；5DX/550Ⅱ型傅里叶-红外光谱仪美国Nicolet公司；Phs-3C型精密pH计上海雷磁仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1白藜芦醇提取液的制备称取20.00g虎杖粗粉，每次以200mL 75%乙醇在60℃下加热回流3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇得浓缩液，在浓缩液中加入pH=2的30%的乙醇进行醇沉，静置过夜，减压抽滤得不溶物为大黄素的粗提物，溶解物即为白藜芦醇提取液[7]，备用。

1.2.2对照品溶液的制备与标准曲线的建立精密称取白藜芦醇标准品0.0300g，用30%乙醇溶解，配成白藜芦醇质量浓度为6.00μg·mL-1的对照品储备液，分别取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL对照品储备液加入到10mL容量瓶中，以30%乙醇定容。

以30%乙醇溶液为参比，在190～600nm范围内进行光谱扫描。在最大吸收波长处，以吸光度-质量浓度绘制标准曲线，求线性回归方程。

1.2.3大孔吸附树脂的预处理将AB-8、NKA-II、NKA-9、D101和H103五种树脂各取适量，分别用乙醇浸泡24h，放出浸液，用乙醇洗至流出液与水1∶5混合不浑浊，以水洗至无醇味。再用5%HCl通过树脂柱，浸泡2～4h，水洗至中性，2%NaOH通过树脂柱，浸泡2～4h，水洗至中性，备用。

1.2.4不同型号大孔吸附树脂对白藜芦醇分离效果的影响准确称取上述预处理后的树脂（去表面水分）1.00g，置于具塞锥形瓶中，再加入0.10mg·mL-1白藜芦醇提取液50.00mL，30℃下振荡吸附24h，测定溶液中白藜芦醇的质量浓度，计算吸附率（De，%）。将吸附后树脂过滤，以50.00mL 60%乙醇振荡解吸24h，测定解吸液中白藜芦醇的质量浓度，计算解吸率（Dd，%），选取最优的大孔吸附树脂进行修饰研究。De和Dd按下式计算：

式中：ρ0吸附前溶液质量浓度（mg·mL-1）；ρ1吸附后溶液质量浓度（mg·mL-1）；ρ2解吸液质量浓度（mg·mL-1）；V1样品溶液体积（mL）；V2解吸液体积（mL）。

1.2.5树脂的修饰鉴于白藜芦醇的化学结构中具有典型的酚羟基，本研究设计在筛选出的树脂中引入能与酚羟基形成氢键的氨基，以增强其选择吸附性[8]。

1.2.5.1氯甲基化反应以常规的Friedel-Craft氯甲基化反应在树脂骨架中引入氯甲基（—CH2Cl）[9]。反应过程如下：取预处理过的大孔吸附树脂50g，加入到带有搅拌器、温度计和回流冷凝器的三口瓶中，再加入250mL氯甲醚。室温下静置4h后开始搅拌，分两次加入75g无水氯化锌，在50～52℃反应8h。冷却至室温，滤出氯化母液，以甲醇反复洗净反应后制得的产物，抽滤，得氯甲基化大孔吸附树脂（简称氯球）。

1.2.5.2接枝苯胺向装有电动搅拌器、回流冷凝管和温度计的三口瓶中，加入DMF溶胀的氯球50g，适量苯胺，升温至60℃，搅拌20h。反应完成后冷却过滤，以乙醇洗涤后再抽提8h，晾干，即得树脂的苯胺修饰产物。

1.2.5.3修饰后大孔树脂的表征用傅里叶红外光谱仪对修饰后的大孔树脂进行结构分析，用扫描电子显微镜观察其形貌。

1.2.6吸附等温线配制系列不同浓度的白藜芦醇提取液。准确称取修饰前后的树脂各2.00g分别加入到锥形瓶中，各取以上白藜芦醇溶液50.00mL，分别加入到锥形瓶中，30℃下振摇吸附24h后，测定此时溶液中白藜芦醇的质量浓度以计算De。

1.2.7pH对吸附率的影响取相同浓度的白藜芦醇提取液，将其pH分别调至3、4、5、6、7。准确称取修饰前后的两种树脂各2.00g分别加入到锥形瓶中，各取以上白藜芦醇溶液50.00mL，分别加入到锥形瓶中，30℃下振摇吸附24h，使其达到吸附平衡。测定此时各溶液中白藜芦醇的质量浓度以计算De。

1.2.8最佳静态吸附时间准确称取修饰前后的两种树脂各2.00g分别加入到锥形瓶中，取白藜芦醇提取液50.00mL，加入到锥形瓶中，30℃下振摇吸附，每30min取样一次，测定各溶液中白藜芦醇的质量浓度以计算树脂对白藜芦醇的De。将吸附饱和的大孔树脂悬浮液离心，弃去上清，将树脂自然晾干，留待备用。

1.2.9乙醇浓度对解吸率的影响取1.2.8项下留待备用的达吸附平衡的干燥树脂等量于不同带塞锥形瓶中，再分别加入50.00mL不同浓度的乙醇溶液，30℃振摇解吸24h，测定此时溶液中白藜芦醇的质量浓度并计算Dd。

2　结果与分析

2.1白藜芦醇的标准曲线的建立

通过光谱扫描确定白藜芦醇的检测波长为306nm，以对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，吸光度Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.1413X+ 0.0217，r=0.9996，白藜芦醇在1.26～5.51μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.2大孔吸附树脂的筛选

表1为五种不同的大孔吸附树脂对白藜芦醇的吸附、解吸性能的比较，综合考虑五种大孔吸附树脂对白藜芦醇的De和Dd，NKA-II树脂最适宜用来分离纯化白藜芦醇。

表1　大孔吸附树脂的筛选（n=3）Table.1　Macroporous resin type of screening（n=3）

2.3NKA-II苯胺修饰后产物的表征

2.3.1红外光谱表征图1为NKA-II与NKA-II苯胺修饰后（NKA-II-苯胺）树脂的红外图谱。从图1的a、b图谱对比可以看出，光谱曲线a在3442.1cm-1的吸收峰为NKA-II树脂的功能基羟基的O-H伸缩振动；树脂氯甲基化后再接枝苯胺，分子中引入氨基，会形成分子间和分子内氢键，氢键的形成使电子云密度平均化体系能量下降，吸收峰向低波数位移，并使吸收强度加强，光谱曲线b中，在3417cm-1处会出现较强的吸收峰；再者在b中1223.7cm-1处的吸收峰为分子中的脂肪族仲胺基的特征峰，系树脂氯甲基化后再接枝苯胺所引入，综合以上信息可知苯胺已被成功引入NKA-II树脂中。

图1　NKA-II树脂与NKA-II-苯胺树脂的红外图谱Fig.1　FT-IR spectra of NKA-II and NKA-II-aniline resin注：a：NKA-II树脂；b：NKA-II-苯胺树脂；图2同。

2.3.2扫描电子显微镜表征图2为NKA-II与NKAII-苯胺树脂的扫描电子显微镜图谱（SEM），从图2的a，b图谱比较可以看出，两者的形貌几乎没有变化，可见在NKA-II上接枝苯胺后，并没有破坏NKA-II大孔吸附树脂的原有结构。

图2　NKA-II树脂与NKA-II-苯胺树脂的扫描电镜图谱Fig.2　SEM of NKA-II and NKA-II-aniline resin

2.4NKA-II-苯胺和NKA-II树脂对白藜芦醇分离纯化效果的比较

2.4.1吸附等温线图3为NKA-II树脂和NKA-II-苯胺树脂对白藜芦醇吸附等温线的比较。在各浓度项下，NKA-II-苯胺树脂对白藜芦醇的吸附率明显强于NKA-II树脂，可见苯胺的引入，明显增强了其对白藜芦醇的吸附。在0.10mg·mL-1时，两者的吸附率均达到最大，故在实验中提取液的白藜芦醇质量浓度取0.10mg·mL-1。

图3　吸附等温线（n=3）Fig.3　Adsorption isotherms（n=3）

2.4.2pH对吸附率的影响图4为在白藜芦醇质量浓度为0.10mg·mL-1时，pH对NKA-II和NKA-II-苯胺树脂吸附白藜芦醇的影响。由图4可知，在各pH项下，NKA-II-苯胺对白藜芦醇的吸附率都明显大于NKA-II；在pH=4时，NKA-II-苯胺树脂的吸附率达到最大，为95.87%，而NKA-II树脂的最大吸附率出现在pH=5，这时的吸附率为87.73%。

图4　pH对吸附率的影响（n=3）Fig.4　Effect of pH on adsorption rate（n=3）

2.4.3最佳静态吸附时间图5为NKA-II和NKAII-苯胺大孔吸附树脂分别在pH=5和pH=4时对白藜芦醇的吸附动力学曲线。由图5可知，NKA-II-苯胺总吸附量增大，其对白藜芦醇的吸附速率也有一定的提高，在300min时，吸附基本达到平衡状态，吸附率为95.85%，此时NKA-II树脂对白藜芦醇的吸附率为87.62%。故最佳静态吸附时间为300min。

图5　吸附动力学曲线（n=3）Fig.5　Adsorption kinetics curves（n=3）

2.4.4乙醇浓度对解吸率的影响图6为乙醇浓度对NKA-II和NKA-II-苯胺树脂解吸白藜芦醇的影响。由图6可知，随着乙醇浓度的增大，大孔树脂对白藜芦醇的解吸率逐渐增强。当乙醇浓度为60%时，两种树脂对白藜芦醇的解吸基本达到平衡状态，解吸率分别为88.75%和92.19%，可见NKA-II-苯胺树脂的解吸性能优于NKA-II树脂。

3　结论

综合考虑五种大孔吸附树脂对白藜芦醇的吸附率和解吸率，NKA-II树脂最适宜用来分离纯化白藜芦醇。对NKA-II树脂进行结构优化，将其氯甲基化，再接枝苯胺，引入了可与白藜芦醇分子中的羟基形成氢键的仲胺键。对白藜芦醇的吸附和解吸性有了明显的增强，当样品溶液溶液pH=4，白藜芦醇质量浓度为0.10mg·mL-1，吸附时间为300min，乙醇60%解吸时，其对白藜芦醇的吸附率由87.62%提高到95.85%，解吸率由88.75%提高到92.19%。可见NKAII-苯胺树脂更适宜用于白藜芦醇的分离纯化。

图6　乙醇浓度对解吸率的影响（n=3）Fig.6　Effect of ethanol concentration on the desorption rate（n=3）

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Modification of the macroporous resin for purifying resevratrol in Polygonum cuspidatum

LI Zuo-dan，JI Jin-gou*，LIU Li，CHEN Yuan-yuan，HE Hui，XU Yi，MU Xiao-jing
（Faculty of Pharmacy，College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

To synthesize a more suitable macroporous resin for purifying resevratrol in Polygonum cuspidatum. The best resin NKA-II，selected in five kinds of macroporous resins by their adsorption and desorption properties to resevratrol，was chloromethylated and grafted with aniline.After purifying the sample extract with NKA-II-aniline resin，the adsorption and desorption capacity to resveratrol were obviously enhanced.When the sample extract at pH=4，the concentration of resveratrol was 0.10mg·mL-1，adsorption time of 300min and elute solution of 60%ethanol，the adsorption rate increased from 87.62%to 95.85%，the desorption rate increased from 88.75%to 92.19%.The results indicated that the new NKA-II-aniline resin may be a promising macroporous resin for the separation and purification of resveratrol in Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum；resveratrol；macroporous resin；modification；purification

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0140-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.021

2014－05－12

李祚丹（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然药物提取。

季金苟（1962-），男，博士，教授，研究方向：药物化学。

重庆市垫江县“121”医药产业科技支持示范工程项目（2012-2015）；重庆市科技攻关（一般）计划项目（CSTC：2011AC5071）。