海洋骨胶原低聚肽钙配合物的稳定性

刘文颖，谷瑞增，林　峰，鲁　军，蔡木易

（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京100015）

海洋骨胶原低聚肽钙配合物的稳定性

刘文颖，谷瑞增，林峰，鲁军*，蔡木易*

（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京100015）

以三文鱼骨为原料制备海洋骨胶原低聚肽钙配合物，以分子量分布和钙含量为指标，研究了热处理、pH和体外胃肠道模拟消化对海洋骨胶原低聚肽钙配合物稳定性的影响。结果表明：海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有较好的热稳定性，各个分子量区间的比例变化不超过2%，配合物的钙含量无显著性差异；海洋骨胶原低聚肽钙配合物在酸性和碱性条件下，分子量小于1000u的总含量略有升高，但升高不到8%，钙含量有所降低，但在广泛的pH范围内仍然有65%以上的钙含量；海洋骨胶原低聚肽钙配合物经过蛋白酶消化后，分子量小于1000u的总含量略有升高，但升高不到6%，经过胃蛋白酶消化和胰蛋白酶共同消化后，仍然有40.5%的钙含量。这说明海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有一定的热稳定性、pH稳定性以及消化稳定性，是一种具有潜力的肽钙补充剂产品。

海洋骨胶原低聚肽，肽钙配合物，热处理，pH，消化模式，稳定性

海洋骨胶原低聚肽是以三文鱼骨为原料，通过酶解、分离、纯化、喷雾干燥等制成的寡肽混合物。鱼骨中90%的蛋白质为胶原、骨胶原及软骨素，然而作为水产品加工中的副产物，三文鱼骨主要用于生产鱼粉、直接作饲料和肥料或丢弃，造成很大的资源浪费。通过生物酶解法制得骨胶原低聚肽，可以回收利用鱼骨中的胶原蛋白[1-2]，并且具有溶解性好，无副作用，安全性高等优点[3-4]，钙是人体必需的常量元素，对维持人体骨骼、呼吸、神经、免疫等系统正常的生理功能具有重要的作用。人类缺钙是全球性的营养问题，高效补钙制剂的研发成为当今社会急需解决的问题[5]。

小肽能与钙离子形成配合物，完整地被转运吸收，需要时又能有效地将钙离子释放出来。与其他补钙剂相比，吸收速度快，补钙效果好[6]。通过将肽钙配合物加工成补钙产品，能够有效解决人体对钙的需求问题。但海洋骨胶原低聚肽钙配合物作为食品原料，加工条件是否影响其稳定性目前尚不明确。因此，本文以三文鱼骨为原料制备海洋骨胶原低聚肽钙配合物，以分子量分布和钙含量为指标，研究温度、pH和蛋白酶消化对海洋骨胶原低聚肽钙配合物稳定性的影响，以期为其在食品工业中的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

三文鱼骨北京中食海氏生物技术有限公司提供；无水氯化钙、无水乙醇、氨水、氯化铵、铬黑T、硫酸镁、三乙醇胺、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、盐酸、氢氧化钠北京化学试剂公司，分析纯；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶诺维信生物技术有限公司；乙腈美国Fisher公司，色谱纯；三氟乙酸英国Alfa Aesar公司，分析纯。

HH-4型数显恒温水浴锅普瑞斯机械有限公司；YG30型喷雾干燥机无锡市阳光干燥设备厂；SHZ-3循环水多用真空泵郑州朋来仪器有限公司；FE20K型pH计瑞士梅特勒-托利多公司；LC-20AD型高效液相色谱仪、凝胶色谱柱（TSKgel G2000SWXL 300mm×7.8mm） 日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1海洋骨胶原低聚肽钙配合物的制备将三文鱼骨用粉碎机粉成鱼骨粉，称取60g溶于1000mL蒸馏水中，90℃处理10min，降温至50℃，调节蛋白溶液的pH至8.5，以每克蛋白质2000单位的酶量加入碱性蛋白酶，酶解3h，然后pH为7，温度调至60℃，以每克蛋白质3000单位的酶量加入木瓜蛋白酶，酶解2h。酶解结束后，100℃灭酶10min。冷却后，10000×g离心30min，取上清液。用截留分子量为1000u的超滤膜超滤，得到分子量小于1000u的滤过液，利用喷雾干燥器进行喷雾干燥，得到海洋骨胶原低聚肽干粉。

称取3g海洋骨胶原低聚肽和1g无水氯化钙，置入500mL锥形瓶中，加入100mL蒸馏水使其全部溶解，在50℃下水浴反应60min，冷却至室温。调节pH为5，之后加入4倍体积的乙醇，室温放置1h。抽滤收集沉淀，干燥后制得海洋胶原低聚肽钙配合物样品，置于干燥器中保存[7]。

1.2.2热稳定性实验将样品配制成浓度为2mg/mL的溶液，分装至50mL离心管中，置于水浴锅中，分别在20、40、60、80℃下水浴，2h后冷却至室温，分别检测其分子量分布和钙质量分数[8-9]。

1.2.3酸碱稳定性实验将样品配制成浓度为2mg/mL的溶液，分装至50mL离心管中，分别用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调节各管pH为3、5、7、9，在37℃的水浴锅中放置2h，冷却至室温后分别检测其分子量分布和钙质量分数[8-9]。

1.2.4体外模拟胃肠道消化实验

1.2.4.1胃蛋白酶消化实验将样品配制成浓度为2mg/mL的溶液，将40mL溶液置于50mL离心管中，用1mol/L HCl调节pH为2，在37℃的水浴锅中预热片刻，加入3%（E/S）胃蛋白酶，混匀后迅速取出样品20mL于另外1支50mL离心管，沸水中灭酶活10min，以此作为样品消化前对照。取出后，将剩余20mL样品置于37℃水浴锅中消化3h，沸水中灭酶活10min，冷却至室温后分别检测消化前后的样品的分子量分布和钙质量分数[8-9]。

1.2.4.2胰蛋白酶消化实验将样品配制成浓度为2mg/mL的溶液，将40mL溶液置于50mL离心管中，用1mol/L NaOH调节pH为6.8，在37℃的水浴锅中预热片刻，加入3%（E/S）胰蛋白酶，混匀后迅速取出样品20mL于另外1支50mL离心管，沸水中灭酶活10min，以此作为样品消化前对照。取出后，将剩余20mL样品置于37℃水浴锅中消化3h，沸水中灭酶活10min，冷却至室温后分别检测消化前后的样品的分子量分布和钙质量分数[8-9]。

1.2.4.3胃蛋白酶消化后再胰蛋白酶消化实验按照1.2.4.1的方法进行胃蛋白酶消化后，用1mol/L NaOH调节pH为6.8，在37℃的水浴锅中预热片刻，加入3%（E/S）胰蛋白酶，混匀后迅速取出样品20mL于另外1支50mL离心管，沸水中灭酶活10min，以此作为样品消化前对照。取出后，将剩余20mL样品置于37℃水浴锅中消化3h于沸水中灭酶活10min，冷却至室温后分别检测消化前后的样品的分子量分布和钙质量分数[8-9]。

1.2.5肽钙配合物的分子量分布测定将样品经孔径0.2μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤。流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸，45∶55∶0.1（v/v/v）；检测波长：220nm；进样体积：10μL；流速：0.5mL/min；柱温：30℃，利用紫外检测器检测，使用GPC软件处理数据。乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量189u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451u）、杆菌酶（分子量1450u）、细胞色素C（分子量12500u）作为肽标准品，配制成0.1%（M/V）溶液，过膜后进样，制作相对分子质量校正曲线[10]。

1.2.6肽钙配合物中钙质量分数的测定取5mL经过不同温度、pH和消化方式处理后的肽钙配合物，转移至透析袋（分子量8000～14000u）中透析48h后，采用EDTA络合滴定法测定肽钙配合物的钙质量分数[7]。将15mL氨-氯化铵缓冲液（pH11）置于100mL锥形瓶中，加入2滴铬黑T指示剂和2滴硫酸镁溶液，摇匀后溶液呈酒红色，然后用0.05mol/L EDTA-2Na滴定，直到溶液呈蓝色为止。将透析后的透析液溶解于20mL蒸馏水中，移入到100mL锥形瓶中，再加入5滴三乙醇胺，之后将滴定呈蓝色的缓冲液倒入样品溶液中，用EDTA-2Na滴定至样品溶液由酒红色变为蓝色。每毫升EDTA-2Na滴定液相当于2.0039mg钙。肽钙配合物中钙质量分数的计算公式为：

肽钙配合物中钙质量分数（%）=m1/m0×100

式中，m1：肽钙配合物中钙的质量，mg；m0：肽钙配合物的质量，mg。

1.2.7统计学处理实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计处理，组间比较采用t检验，若p＜0.05，两者有显著性差异。

2　结果与讨论

2.1相对分子质量校正曲线及方程

由4种已知分子量的标准品配制成标准溶液后进样，通过凝胶渗透色谱图得出4种标准品的保留时间，以相对分子质量的对数（lgMW）对保留时间（t）作图得到相对分子质量校正曲线（见图1）。其方程为：lgMW=6.7895-0.1984t，R2=0.9982。再将经过不同方式处理后的肽钙配合物样品进样以后，用液相数据处理软件（GPC软件）将样品的凝胶色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品的分子量及其分布范围。

图1　相对分子质量校正曲线图Fig.1　Molecular weight calibration curve

2.2海洋骨胶原低聚肽钙配合物的热稳定性

海洋骨胶原低聚肽钙配合物经过不同的温度处理后，其分子量分布凝胶色谱图如图2所示，利用GPC软件处理后，分子量分布数据如表1所示。由图2和表1可知，海洋骨胶原低聚肽钙配合物分别在20、40、60、80℃水浴2h之后，分子量分布凝胶色谱图基本没有变化。各个分子量区间的比例变化不超过2%，分子量小于1000u的总含量均在72%左右。

图2　不同温度下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的分子量分布凝胶色谱图Fig.2　Gel chromatogram of molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different temperatures

表1　不同温度下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的分子量分布Table.1　Molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different temperatures

不同温度处理后，用透析的方法测定海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量，结果如图3所示。与对照相比，海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量无显著性差异（p＞0.05），表明海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有较好的热稳定性，在加工过程中，温度的变化对海洋骨胶原低聚肽钙配合物的影响很小。包小兰[9]对大豆肽钙复合物在不同温度条件下的热稳定性进行了研究，与本研究结果一致，大豆肽钙复合物对高温加热具有较好的稳定性。

2.3海洋骨胶原低聚肽钙配合物的酸碱稳定性

海洋骨胶原低聚肽钙配合物经过不同的pH处理后，其分子量分布凝胶色谱图如图4所示，利用GPC软件处理后，分子量分布数据如表2所示。由图4可知，海洋骨胶原低聚肽钙配合物在pH分别为3、5、7、9的条件下水浴2h之后，分子量分布凝胶色谱图变化不大。由表2可见，海洋骨胶原低聚肽钙配合物在pH7的条件下，分子量小于1000u的总含量为71.82%，在酸性条件和碱性条件下，分子量小于1000u的总含量略有升高，有可能是肽与钙形成的大分子环装结构在强酸或强碱的作用下断裂，形成小分子的结构。但分子量小于1000u的总含量升高不到8%，这表明海洋骨胶原低聚肽钙配合物在广泛的pH范围内具有一定的稳定性。

图3　不同温度下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量Fig.3　Calcium content of MBCP-Ca treated by different temperatures

图4　不同pH下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的分子量分布凝胶色谱图Fig.4　Gel chromatogram of molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different pH values

表2　不同pH下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的分子量分布Table.2　Molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different pH values

不同pH处理后，用透析的方法测定海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量，结果如图5所示。与对照相比，海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量均降低，其中在pH3、5、9条件下，其钙含量变化有显著性差异（p＜0.05），降低了18.7%～34.4%。在pH7条件下，钙含量降低了11.7%，表明海洋骨胶原低聚肽钙配合物在中性条件下，钙含量降低较少，而在强酸强碱条件下，钙含量降低较多。从图5可以看出，海洋骨胶原低聚肽钙配合物在广泛的pH范围内仍然有65%以上的钙含量，这表明海洋骨胶原低聚肽钙配合物中肽与钙的结合具有一定的稳定性。这可能由于海洋骨胶原低聚肽仅具有蛋白质结构中的一级结构，与高级结构相比比较稳定，因此对温度、酸碱作用的耐受能力强一些[9]。

图5　不同pH下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量Fig.5　Calcium content of MBCP-Ca treated by different pH values

2.4海洋骨胶原低聚肽钙配合物的体外消化稳定性

海洋骨胶原低聚肽钙配合物分别经胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，其分子量分布凝胶色谱图如图6所示，利用GPC软件处理后，分子量分布数据如表3所示。由图6和表3可知，经过不同的消化模式，海洋骨胶原低聚肽钙配合物分子量分布凝胶色谱图变化不大。经过蛋白酶消化后，海洋骨胶原低聚肽钙配合物的组分中分子量小于1000u的总含量略有升高，但升高不到6%，分子量小于1000u的总含量在72%～79%之间。与未消化对照组相比，经过消化后，大于1000u和500～1000u的组分所占比例略有降低，140～500u和小于140u的组分所占比例略有升高。这表明分子量相对较大的肽段经过消化后分解成小分子量的肽段或氨基酸。包小兰[9]考察了大豆肽钙复合物的消化稳定性，结果与本文一致，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后，大豆肽钙复合物中大分子量组分含量减少，小分子量组分含量增加，但变化不明显，对消化酶的降解具有一定的抗性。

图6　不同消化方式下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的分子量分布凝胶色谱图Fig.6　Gel chromatogram of molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different digestion modes

表3　不同消化方式下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的分子量分布Table.3　Molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different digestion modes

图7　不同消化方式下海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量Fig.7　Calcium content of MBCP-Ca treated by different digestion modes

不同消化方式处理后，用透析的方法测定海洋骨胶原低聚肽钙配合物的钙含量，结果如图7所示。与对照相比，海洋骨胶原低聚肽钙配合物在胃蛋白酶、胰蛋白酶分别消化作用3h后，钙含量分别为58.7%、53.4%，先经过胃蛋白酶消化再经过胰蛋白酶消化后，海洋骨胶原低聚肽钙配合物仍然有40.5%的钙含量。这说明海洋骨胶原低聚肽钙配合物对消化酶的降解具有一定的耐受性。本实验模拟人体胃肠消化情况，表明海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有一定的耐受胃肠道中胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。聂瑞艳等[11]对罗非鱼鱼鳞肽钙复合物进行了抗消化实验，结果表明肽钙复合物经过胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，钙结合量降低32%，证明其具有一定的抗消化性。

海洋骨胶原低聚肽的结构是影响海洋骨胶原低聚肽钙配合物中钙含量的重要因素。从消化稳定性实验结果可以看出，海洋骨胶原低聚肽钙配合物的组分中分子量小于1000u的总含量增加不到6%，但其钙含量降低了59.5%，分子量较小的变化导致钙含量较大的变化。海洋骨胶原低聚肽钙配合物的酸碱稳定性实验结果中也表明了这一点。

3　结论

以三文鱼骨为原料制备出海洋骨胶原低聚肽钙配合物，通过温度、pH和体外模拟胃肠道消化实验，对海洋骨胶原低聚肽钙配合物的稳定性进行了研究。结果表明，海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有较好的热稳定性，各个分子量区间的比例变化不超过2%，配合物的钙含量无显著性差异；海洋骨胶原低聚肽钙配合物在酸性和碱性条件下，分子量小于1000u的总含量略有升高，但总含量升高不到8%，钙含量有所降低，但在广泛的pH范围内仍然有65%以上的钙含量；海洋骨胶原低聚肽钙配合物经过蛋白酶消化后，分子量小于1000u的总含量略有升高，但升高不到6%，先经过胃蛋白酶消化再经过胰蛋白酶消化后，海洋骨胶原低聚肽钙配合物仍然有40.5%的钙含量。这说明海洋骨胶原低聚肽钙配合物具有一定的热稳定性、pH稳定性以及消化稳定性，是一种具有潜力的肽钙补充剂产品。

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Stability of calcium-chelating marine bone collagen oligopeptides

LIU Wen-ying，GU Rui-zeng，LIN Feng，LU Jun*，CAI Mu-yi*
（Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Calcium-chelating marine bone collagen oligopeptides（MBCP-Ca）were prepared by using salmon bone as raw material.Taking molecular weight distribution and calcium content as indicators，the effects of temperature，pH and in vitro simulated gastrointestinal digestion on the stability of MBCP-Ca were investigated. Results showed that：MBCP-Ca had good thermal stability.The change of the molecular weight distribution ranges did not exceed 2%and the calcium content of MBCP-Ca showed no significant difference.In the acidic and alkaline conditions，the molecular weights below 1000u of MBCP-Ca were slightly elevated，but the content did not exceed 8%.The calcium content of MBCP-Ca decreased，but was still higher than 65%.After digested by proteases，the molecular weights below 1000u of MBCP-Ca were slightly elevated，but the content did not exceed 6%.After digested by pepsin and trypsin together，the calcium content of MBCP-Ca were 40.5%.The results indicated that MBCP-Ca had good thermal stability，pH stability and digestion stability and it was a peptide-calcium supplement product with promise.

marine bone collagen oligopeptides；calcium-chelating peptides；heat treatment；pH；digestion mode；stability

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0111-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.015

2014－07－01

刘文颖（1984-），女，硕士研究生，工程师，研究方向：食源性低聚肽研究。

蔡木易（1962-），男，本科，教授级高工，研究方向：功能肽研究与产业化。

鲁军（1973-），男，博士，高级工程师，研究方向：食品营养与生物技术。

国家十二五科技支撑项目（2012BAD33B04-02）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102205-02）；北京市科委农村中心国家现代农业科技城成果惠民科技示范工程项目（Z131100003113010）；科技北京百名领军人才培养工程项目（Z131110000513026）。