脱脂豆粕变性程度对于产物分离蛋白结构性质及贮藏稳定性影响

郭凤仙，何志勇，黄小林，熊幼翎，陈　洁，2，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品安全与营养协同创新中心，江苏无锡214122）

脱脂豆粕变性程度对于产物分离蛋白结构性质及贮藏稳定性影响

郭凤仙1，何志勇1，黄小林1，熊幼翎1，陈洁1，2，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品安全与营养协同创新中心，江苏无锡214122）

为研究不同变性程度的原料所制备的大豆分离蛋白（SPI）贮藏稳定性及其与蛋白结构的关系，实验分别以三批不同变性程度（72.6%，29.4%和1.8%）的低温脱脂豆粕制备SPI，以大豆为原料提取的SPI为对照，考察其在贮藏（37℃）10周过程中溶解度变化及其与初始蛋白的聚集和解离程度的对应关系。结果表明：原始SPI（对照）显示出最高初始溶解度（93%），经10周贮藏后其溶解度下降幅度最小。原料变性程度越高，对应SPI初始溶解度越低；而初始溶解度越高，其在贮藏过程中下降越快，10周后三者溶解度几乎降至同一水平。同时，高变性程度原料制备的SPI聚集或解离程度也越高，不利于SPI短期贮藏中（≤6周）的溶解度；原料变性程度和蛋白初始溶解度均相当时，聚集或解离程度高的SPI在贮藏后期（＞6周）溶解度损失更快。此外，引起蛋白聚集的主要共价键是二硫键，但除此之外也在变性程度原料的SPI中也发现其他共价键。

脱脂豆粕，大豆分离蛋白（SPI），贮藏，溶解度

不同公司生产的商业大豆蛋白在结构特征和功能特性存在很大差别，如变性程度、溶解性及表观粘度等[10]。造成这些差异的原因除了加工工艺上有所不同外，原料的影响也不可排除，如原料豆的品种、豆粕的加工及贮藏史等。黄友如等[11]研究发现经热处理后的脱脂豆粕中蛋白多肽链会发生局部展开，同时也生成了大分子聚体。王浩冉[12]也发现经干热处理的SPI中含大颗粒的聚集。蛋白原有的结构遭受的破坏会影响其贮藏稳定性[13]。而作为SPI的原料，脱脂豆粕在制备SPI前所经历加工贮藏都可能使其中的蛋白遭受破坏，从而会影响到终产品的贮藏稳定性。因此，本实验主要研究不同批次的豆粕制备的SPI贮藏稳定性是否有差异，初步探讨造成这些差异可能的原因。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大豆（台湾-292） 无锡雪浪市场种子供应站；低温脱脂豆粕秦皇岛益海嘉里粮油有限公司；PE真空包装袋上海精品包装机械有限公司；二羟甲基氨基甲烷（Tris）、过硫氨酸、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚蓝、考马斯亮蓝R250美国Fisher Scientific公司；5，5’-二硫代二硝基苯甲酸盐（DTNB）、三硝基苯磺酸（TNBS）、凝胶色谱分子量标样、丙烯酰胺及N，N’-甲叉双烯酰混合凝胶储液、十二烷基苯硫酸（SDS） 美国Sigma Chemical公司；L-亮氨酸、亚硫酸钠、甲醇、冰醋酸、过硫酸铵国药集团化学试剂有限公司。

JZ7114型粉碎机上海朝阳微电机厂；Avanti J-26 XP型高速离心机美国BECKMAN公司；QZ-5型高速离心喷雾干燥机无锡锡山林洲干燥机厂；KDF-103F型半自动微量凯式定氮仪上海纤检仪器有限公司；Q2000型差示扫描量热仪（DSC） 美国TA公司；SHP-150型生化培养箱上海森信实验仪器有限公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪日本岛津公司；KW-804型蛋白凝胶柱日本Shodex公司；Mini-PROTEAN 3 Cell凝胶电泳仪美国Bio-Rad公司；BVPJ-500TS型真空包装机嘉兴艾博不锈钢机械工程有限公司。

1.2实验方法

1.2.1SPI的制备及贮藏以采自夏、秋、冬三个不同季节的商业低温脱脂豆粕为原料，参考Liu and Xiong[14]方法进行蛋白提取，得到的蛋白溶液进行喷雾干燥（入口温度：180℃；出口温度：80℃），所得的三个样品分别记为SPI1、SPI2、SPI3。对照为参考Jiang等[15]的方法从大豆中提取的SPI样品。将得到的蛋白粉用PE袋真空包装，在37℃恒温箱中贮藏。所制得SPI经凯式定氮（N×6.25确定其纯度均大于96.5%（w/w，干基）。

1.2.2变性程度豆粕的变性程度用差式扫描量热量仪（DSC）进行测定。将豆粕中新鲜提取的大豆分离蛋白分散于纯水中（20%，w/v），然后置于专用铝盘中（14～18mg），以空的铝盘作为参照进行测定。测定以5℃/min的速度从25℃升温到120℃。每个样品重复测定两次，取平均值进行报道。以从大豆中提取的SPI为对照，各豆粕中蛋白的变性程度表示为：

1.2.3溶解度将固体SPI分散在去离子水中（2%，w/v），室温下搅拌1h使样品溶解，静置2min后，将上层液倒入离心管中离心15min（10000×g）。取上清液10mL，采用凯式定氮测定蛋白浓度。溶解度表示为：

“大学老师介绍了一个幼儿园教师，说我在高校教书，人忠厚老实，蛮有上进心，连续两年评了先进，还单枪匹马供了楼……可惜老师多嘴说了一句，说我诗也写得好，小有名气——谁知那个女的就索性不见了，据老师说，她吓破了胆。彼时在热播电视剧《人间四月天》，诗人如徐志摩等都是风流成性的，那我也不保险——”

1.2.4自由氨基参考Lertittikul等[16]的实验方法，取125μL蛋白溶液，加入2mL的磷酸盐缓冲液（pH8.2）和1mL 0.01%的TNBS，振荡混匀后于50℃下避光反应30min，再加入2mL 0.1mol/L的Na2SO3终止反应，冷却至室温（15min），测定样液在420nm处的紫外吸光值。自由氨基含量根据L-亮氨酸含量的标准曲线来确定。空白为在相同操作下用去离子水代替反应液。

1.2.5分子量分布采用HPLC来研究分子量分布，使用岛津高效液相系统和KW-804蛋白凝胶柱和紫外检测器。柱子的洗脱极限为10，分离柱柱效大于20000。流动相为50mmol/L pH7.0磷酸盐缓冲液，离子强度0.3mol，洗脱速率为1mL/min，洗脱液在280nm处检测。

1.2.6凝胶电泳参考Liu和Xiong[14]方法对SPI样品进行SDS-PAGE电泳。采用4%的浓缩胶和12%的分离胶，浓缩胶电流控制在20mA，分离胶控制在40mA。用0.2%的考马斯亮兰溶液染色2h，最后用含40%甲醇和10%醋酸的脱色液脱色10h。

1.2.7数据分析数据中的显著性分析（p＜0.05）采用LSD测试（SPSS Statistical Software，美国），显著性分析中每个指标中的所有数据均为同组分析结果。

2　结果与讨论

2.1脱脂豆粕的变性程度

原料的变性程度是通过DSC测定豆粕中新鲜提取的SPI变性程度来表征。结果如图1所示。对照为以大豆为原料制备的原始SPI。各样品都显示两个热流峰，以对照为例，峰值分别为77.8℃和96.1℃，对应大豆β-伴球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）。对照中蛋白热焓值最大，证明其蛋白的结构最接近原始蛋白。SPI1的蛋白热流峰最小，对应的变性程度为72.6%；SPI2的变性程度为29.4%；SPI3的热焓值最大，变性程度仅为1.8%。同时，与对照相比，SPI2和SPI3中的变性温度都升高了约2℃，说明蛋白质结构发生了变化。Lakemond等[17]发现11S中的酸性多肽链的展开很可能与其变性温度的升高有关。SPI1、SPI2、SPI3对应的原料分别采自夏、秋、冬三个季节，所以变性程度的差异很可能是由于不同季节原料所处的环境温度或在加工前经历的贮藏时间不同造成的。

图1　DSC测定的不同批次的脱脂豆粕中提取的SPI初始热流图及变性程度Fig.1　DSC thermograms of initial SPI samples extracted from different batches defatted soy flakes

2.2SPI贮藏过程中溶解度的变化

图2为不同变性程度的商业低温脱脂豆粕制备的SPI在37℃下贮藏10周过程中溶解度的变化情况。变性程度越高的脱脂豆粕所制备的SPI初始溶解度越低，SPI1＜SPI2＜SPI3＜对照。低变性程度原料制备的SPI溶解度虽然高，但在贮藏过程中损失最快，10周后三者几乎降到同一水平。而对照在贮藏后期（＞6周）溶解度几乎稳定，10周内溶解度下降幅度最小。同时发现，虽然SPI3的原料变性程度和初始溶解度均接近对照，但其溶解度下降速度在贮藏后期（＞6周）远高于对照。这是因为DSC测定的热流谱图即包括蛋白变性的引起的焓变，又包括蛋白聚集的焓变[18]。根据Lumry-Eyring模型，蛋白的不溶性沉淀产生的过程包括蛋白结构的部分展开，聚集，聚集体的增长，最后变为不溶性大聚集体[19]。Chun Liu等[20]的研究也发现SPI溶解度的下降伴随着蛋白亚基的降解。Damodaran[21]认为在特定条件下，蛋白质溶解度主要是由蛋白质与蛋白质，以及蛋白质与水之间相互作用的平衡制约的。因此，除原料的变性程度，很可能还存在其他影响SPI贮藏稳定性的因素，如初始蛋白的聚集和解离。

图2　不同批次的脱脂豆粕中提取的大豆分离蛋白在贮藏过程溶解度的变化Fig.2　The changes in protein solubility of SPI during storage that extracted from different batches defatted soy flakes

2.3初始SPI的解离及聚集程度

2.3.1自由氨基通过测定自由氨基的含量来衡量各SPI的解离程度以L-亮氨酸为基准物测定的自由氨基含量标准曲线如图3所示，线性拟合方程为y= 0.158x+0.016（R2=0.999）。如图4所示，SPI1的含量略低于对照，这可能是蛋白聚集使得部分氨基端包埋在分子内部造成的。SPI2和SPI3的自由氨基含量都远高于对照，其中SPI2含量最多，约为对照的2.5倍，这很可能来源于蛋白中多肽链发生解离。

图3　以亮氨酸为基准物的自由氨基含量标准曲线Fig.3　The standard curve of free amino group content using L-leucine as reference

图4　不同批次脱脂豆粕中提取的SPI初始的自由氨基含量Fig.4　The free amino groups of initial SPI samples extracted from different batches defatted soy flakes

2.3.2分子量分布凝胶排阻色谱（SEC）测定的蛋白分子量分布也可以揭示蛋白的聚集或解离情况。如图5所示，峰1为大聚集体（＞1000ku）；峰2是中等聚集体（670～1000ku）；峰3主要是7S和11S（670～43ku）；其他小分子量的峰（＜43ku）为蛋白分解后的肽段，如峰4和峰5。对照中含有微量（＜1%）的中等聚集体（670～1000ku），85%（相对峰面积）以上的蛋白是以7S和11S的形式存在，显示最低的聚集和解离程度。而高变性原料制备的SPI1中70%以上的蛋白分子都集中在分子量大于1000ku的大聚集体，峰3几乎消失，剩余部分基本都以小肽链形成存在，显示出最高的聚集程度。中等变性的原料对应的SPI2中除了含有部分中等聚集体外，其小分子肽段（＜43ku）有两个明显的高峰（峰4和峰5），含量占到55%以上，而7S和11S对应的峰所占比例非常小，说明该蛋白即有一定的聚集程度，又有较大的解离程度。与前两样品相比，低变性原料中提取的SPI3的分子量分布与对照最为接近，含有少量的中等聚集体，7S和11S含量及小分子肽段含量均约为40%，表现出低聚集和解离程度，这一结果与自由氨基测定结果相一致。

图5　不同批次的脱脂豆粕中提取的SPI可溶性部分的分子量分布Fig.5　The molecular weight distribution of SPI extracted from different batches of defatted soy flakes

总之，高变性程度的豆粕对应的SPI中高的聚集或解离程度，从而不利于蛋白的溶解度。而当原料的变性程度相当，高聚集或解离程度的SPI在长期贮藏过程中（＞6周）溶解度下降越快。

2.4初始SPI的电泳分析

为揭示蛋白亚基组成以及共价性聚集情况，实验对SPI的可溶性部分进行非还原和还原电泳。图6（a）为SPI非还原电泳结果，浓缩胶顶部及分离胶中大于97ku的条带区间为共价聚集体，各样品均含有明显的聚集体条带，其中对照组含量最少，高变性原料制备的SPI1中的聚集体含量最多，其次SPI3和SPI2。此外，对比各蛋白的亚基组成，可以看出对照组中A和B亚基条带最少，而其他三组样品的这两个亚基条带非常明显，验证了对照组解离程度最小。在还原条件下，如图6（b）所示，对照、SPI2和SPI3中的聚集体几乎完全消失，SPI1中聚集体的也大大减少了。这一结果说明SPI共价聚集体几乎都是通过二硫键结合的。而高变性程度原料制备的SPI1经还原后还残留一小部分聚集体，说明还有其他非二硫键的共价键参与蛋白聚集。

图6　不同批次脱脂豆粕中提取的大豆分离蛋白（SPI）可溶性部分的SDS-PAGE电泳图Fig.6　The SDS-PAGE profiles of soluble parte of soy protein isolate（SPI）that extracted from different batches of defatted soy flakes

3　结论

不同变性程度的脱脂豆粕可能在制备SPI前经历的加工储藏史有所不同，导致最终所提取的SPI贮藏稳定性的差异，如溶解度的损失情况。这一差异除了与原料变性程度有关外，还与豆粕中蛋白的结构特性有关。原料变性程度越高，所制备的SPI聚集或解离程度越高，在短期贮藏时间内（≤6周）溶解度越差，如夏季的脱脂豆粕中提取的SPI。原料变性程度相似，所制备的SPI初始溶解度也相当的情况下，高的聚集或解离度很可能会加速其溶解度在贮藏过程的下降。

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Effect of the denaturation degree of defatted soy flakes on structural properties and storage stability of produced protein isolate

GUO Feng-xian1，HE Zhi-yong1，HUANG Xiao-lin1，XIONG You-ling1，CHEN Jie1，2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，and School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The objective of this study was to reveal the influence of different denatured material on the storage stability of soy protein isolate（SPI），as well as its relationship with the structural properties.SPI that prepared from soybeans was considered to be the control.Three SPI samples were extracted from defatted soy flakes（with denaturation degrees of 72.6%，29.4%，1.8%，separately）and stored（37℃）for 10 weeks.The storage stability was evaluated by tracking protein solubility during storage and the initial structural properties were then determined.Results showed that，the control exhibited the highest protein solubility（93%）at the initial state of storage，and the least decline after 10-wk storage.The highest denaturation degrees of the defatted flakes，the lowest initial solubility was found in the resulted SPI，SPI with higher initial solubility showed faster decline rate during storage，reduced to the same level after 10 weeks.Furthermore，SPI that extracted from high-denatured material displayed high aggregation or dissociation degree，which was harmful to the protein solubility of short-time（≤6wk）stored sample.When the samples shared similar denaturation degree and the initial solubility，SPI with higher level of aggregation or dissociation exhibited higher rate of solubility decline after long-time（＞6wk）storage.In addition，disulfide linkage was the main covalent bond mediated in protein aggregation，and some other covalent bond was also found in high denatured sample.

defatted soy flake；soy protein isolate（SPI）；storage；protein solubility

TS251.1

A

1002-0306（2015）04-0097-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.012

2014－05－23

郭凤仙（1984-），女，在读博士研究生，研究方向：食品蛋白质功能。

陈洁（1969-），女，博士，教授，研究方向：食品蛋白质功能，食品安全监测。

国家自然科学基金（31271946）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20100093120005）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（1026010241111090）。