热-超声波联合对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果研究

施红英，张静岩，吴卫东，陈　晨，廖红梅，丁占生

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

热-超声波联合对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果研究

施红英，张静岩，吴卫东，陈晨，廖红梅*，丁占生

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

研究了32～52℃条件下，热处理以及热-超声波联合处理对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果，分析了温度对热-超声波联合杀菌效果的影响。结果表明：32～52℃热处理杀菌效果远远达不到卫生标准；而热-超声波联合作用杀菌效果显著增强，在52℃下，190、380、570W分别处理40、30min和30min即可达到平板菌落计数法检测限；在热-超声波联合处理中，较低温度（32～47℃）对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果贡献较小，杀菌效果主要取决于超声波作用；而致死温度（52℃）体现协同杀菌效应，增强杀菌效果，提高杀菌速率。

鼠伤寒沙门氏菌，热-超声波联合，杀菌，温度

超声波技术在食品工业中已经得到广泛应用，例如杀菌、清洗、灭酶、均质、结晶化、消泡、脱气以及提取酚类化合物、精油等[1]。在杀菌方面，超声波可作为一种有效的辅助杀菌方法，广泛应用于液态食品如果汁（包括橙汁、胡萝卜汁、苹果汁）、啤酒、牛奶和液蛋[2-3]；少量应用于固态食品清洗消毒，包括莴苣、番茄和草莓[4-6]；同时该方法也成功用于废水处理、饮用水消毒[7]。

超声波杀菌主要归因于超声过程中由于空化泡破裂产生瞬间高温、高压、剪切力以及自由基的声化学效应[8]。单独采用超声波杀菌效果有限，通常考虑结合其他技术联合杀菌。热-超声波联合杀菌已被证实具有较好的杀菌效果。例如Salleh-Mack和Roberts报道采用低温条件下（30°C）超声波处理大肠杆菌（E.coli ATCC 25922）9～11min可以使其降低4～5.4个对数，而升高温度（60°C）仅处理3min即可达到降低5个对数[9]。Ordonez[10]、方祥等[11]也报道热-超声波联合处理比单独采用相同温度热处理的的杀菌效果更好，目前未见有报到分析热-超声波联合处理对杀菌效果的影响。

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种食品中常见致病菌，在肉、奶、蛋及其制品中比较常见，在果蔬及其制品中也容易感染从而引发腹泻等不良症状。本文主要研究热-联合超声波对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果，分析温度对热-联合超声波杀菌的影响，为该技术的应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

鼠伤寒沙门氏菌购自中国普通微生物菌种保藏中心（China Microbiological Culture Collection Center，CMCC），编号为CMCC 50115；牛肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、葡萄糖、氯化钠、琼脂粉均购自北京奥博星生物科技有限公司；牛肉膏蛋白胨酵母抽提物固体培养基（beef peptone yeast broth，BPY）配方牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂粉15.0g/L，调pH7.0。

Scientz-IID型超声波细胞破碎仪宁波新芝生物技术有限公司；DC0506型低温恒温槽上海衡平仪器仪表厂；SW-CJ-2FD型无菌操作台苏州净化设备技术有限公司；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；SPX型智能生化培养箱南京实验仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1微生物培养根据CMCC指导书将鼠伤寒沙门氏菌的冻干菌粉经过BPY液体培养基活化两次以后活力得到复壮，并接种在BPY斜面培养基上2℃保藏。用接种环接种3环到100mL培养基中，37℃下培养。采用比浊法测定鼠伤寒沙门氏菌的生长曲线，确定其达到稳定生长初期所需时间为10h，以得到菌活力较强且稳定的菌液。培养好的菌液用BPY培养基稀释到107CFU/mL，作为后续实验的菌液样品。

1.2.2热-超声波联合处理将与低温恒温槽连接的夹套烧杯用75%酒精浸泡30min，然后用无菌去离子水冲洗3遍，再用菌液润洗1次，加入60mL菌液，开启水浴循环使菌液预热到设定温度，启动超声波（超声频率为20～25kHz），在不同温度、功率下进行热-超声波联合处理40min，每间隔5min取样，迅速于4℃下冷却，并立即测定残存菌数。同时做热处理对照，即在不开启超声波的条件下，采用与热-超声波处理一致的温度、时间、加样量条件处理菌液，并取样以测定残存菌数。

1.2.3微生物数量测定采用平板计数法测定微生物数目。将菌液用0.85%生理盐水以10倍稀释法进行逐级稀释，根据细菌数量选择合适的稀释度进行逐级稀释，吸取连续3个不同稀释度的稀释样1.0mL于灭菌平皿中，倒入约15mL BPY琼脂培养基，摇匀后在（37±0.1）℃条件下培养24h。并记录菌落数。杀菌效果采用残活率对数值（logN/N0）表示，其中：N0为处理前的初始微生物数量（CFU/mL）；N为处理后的微生物数量（CFU/mL）。

1.2.4数据统计分析所有实验均重复3次，数据采用方差分析（ANOVA）。数据采用Origin 7.5进行统计并绘图。

2　结果与分析

2.1热处理对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果分析

如图1所示，32～42℃热处理40min后，BPY培养基中鼠伤寒沙门氏菌均存在一定程度增殖现象，最高达到增加0.7个对数；47℃热处理后，鼠伤寒沙门氏菌的残存数量基本保持不变（p＞0.05）；52℃热处理15min之内，鼠伤寒沙门氏菌数量有所降低，但变化不显著（p＞0.05），而处理20～40min后，其残存菌数显著下降（p＜0.05）。在52℃热处理40min之后，鼠伤寒沙门氏菌数量降低1.2个对数。表明单独采用热处理鼠伤寒沙门氏菌，其热致死温度大于47℃，且处理时间较长。

图1　32～52℃下热处理对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果Fig.1　Effect of mild heat on inactivation of Salmonella typhimurium at 32～52℃

2.2热-超声波联合对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果分析

如图2所示，为热-超声波联合处理在190W、32～52℃条件下对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果。在32～52℃条件下，经过热-超声波联合处理后鼠伤寒沙门氏菌残存菌数呈现不同程度降低，较相同温度热处理（图1）其杀菌效果显著增强（p＜0.05）；且杀菌效果随着处理时间延长而增强，在52℃条件处理40min达到完全灭菌，微生物数量降低了7.88个对数；在32～47℃，杀菌效果随温度升高有所增强，但并未显著增强（p＞0.05）经过各温度的热-超声波联合处理40min后，鼠伤寒沙门氏菌降低了2.93～3.67个对数；而当温度进一步升高到52℃，杀菌效果显著增强（p＜0.05）；杀菌曲线呈现线性趋势。

如图3所示，为热-超声波联合处理在380W、32～52℃条件下对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果。由图3可以得出，在各温度条件下，杀菌效果随着处理时间延长而增强；当温度由32℃升高到37～47℃，杀菌效果显著增强（p＜0.05）；温度在37～47℃之间，杀菌效果无显著变化（p＞0.05），处理40min后鼠伤寒沙门氏菌降低了4.29～4.58个对数；当温度进一步升高到52℃，杀菌效果剧烈而显著增强，在380W下，处理15min即达到降低6个对数，处理30min即达到完全灭菌。另外，在较低温度条件下（32～47℃），杀菌曲线呈线性趋势，而在较高温度下（52℃），呈现5min杀菌缓慢、5～20min快速杀菌、20～40min趋于平缓及至完全灭菌的三段式趋势。由此可见，在380W条件下，温度为37～47℃对杀菌效果影响不大，而当温度进一步升高到52℃，则在较高温度下改变了鼠伤寒沙门氏菌的杀菌模式。

图3　在380W条件下低温辅助超声波（32～52℃）对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果Fig.3　Effect of thermosonication on inactivation of Salmonella typhimurium at 380W and 32～52℃

如图4所示，为热-超声波联合处理在570W、32～52℃条件下对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果。由图4可以得出，在各温度条件下，杀菌效果随着处理时间延长而增强。在32～52℃范围内，杀菌效果变化趋势与380W条件下类似，即从32℃升高到37～47℃，杀菌效果显著增强（p＜0.05）；而37～47℃之间没有显著变化（p＞0.05）；再次升高到52℃后杀菌效果剧烈而显著增强（p＜0.05）。各温度条件下，杀菌曲线趋势也与380W条件下类似，即32～47℃呈现线性下降、52℃呈现慢-快-慢的三段式杀菌趋势。在37～47℃条件下处理40min，鼠伤寒沙门氏菌降低了4.35～4.72个对数，在52℃条件处理20min，使鼠伤寒沙门氏菌降低了7个对数以上。

图4　在570W条件下低温辅助超声波（32～52℃）对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果Fig.4　Effect of thermosonication on inactivation of Salmonella typhimurium at 570W and 32～52℃

由图2～图4可以得出，在32℃条件下，杀菌效果并未随功率增强而增强。当温度在37～47℃范围，在190W条件下，随着温度升高，杀菌效果有所增强，但变化并不显著（p＞0.05），在380～570W条件下，温度对杀菌效果几乎没有影响，杀菌曲线大多聚集在一起。在52℃下，当功率由190W增强为380W，杀菌效果显著增强，杀菌速率增大；当功率进一步增强为570W时，杀菌效果变化并不显著，即功率对其影响不大。

3　讨论

在32～42℃条件下，热处理对鼠伤寒沙门氏菌具有增殖影响；在52℃条件下残存鼠伤寒沙门氏菌数量才有明显降低。在对应相同温度下，热-超声波联合处理杀菌效果具有显著优势（图1～图4）。说明在热-超声波联合处理中热和超声波具有协同杀菌效应。但在32～47℃条件下，热效应对联合杀菌的影响较小，超声波的作用占主导地位。在52℃条件下，二者的协同效应显著增强。热处理协同促进超声波杀菌效果增强的现象在研究大肠杆菌杀菌时已被证实[9，12]。Salleh-Mack和Roberts报道在30℃条件下使大肠杆菌ATCC 25922降低4～5.4个对数需要9～11min，而结合热处理在60℃条件下仅需处理3min就可达到降低5个对数以上[9]。说明热-超声波联合杀菌在食品加工过程中具有巨大潜力。

温度对热-超声波联合处理杀菌效果影响比较复杂。由图1可知，在营养丰富的BPY培养基中，32～42℃是鼠伤寒沙门氏菌的增殖温度，47℃为其亚致死温度，52℃为其致死温度。进而由图2～图4可知，在联合超声波处理的情况下，亚致死及增殖温度（32～47℃）对热-超声波联合处理鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果贡献不大，杀菌效果主要取决于超声波作用；而致死温度（52℃）体现协同杀菌效应，增大杀菌速率。Ugarte-Romero等[13]曾报道超声波增强致死温度（50℃）对李斯特氏菌的杀菌效果。这主要是由于中等强度温度的热处理会破坏革兰氏阴性细菌外层的细胞外膜，从而有利于超声波作用[14]。

4　结论

由实验可知，32～52℃热处理杀菌效果很不理想，而热-超声波联合作用杀菌效果显著增强。在52℃条件下，190、380和570W分别处理40、30和30min即可达到平板菌落计数法检测限。在热-超声波联合处理中，增殖及亚致死温度（32～47℃）对热-超声波联合处理鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果贡献不大，杀菌效果主要取决于超声波作用；而致死温度（52℃）体现协同杀菌效应，增大杀菌速率。

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Study on effect of temperature on inactivation of Salmonella typhimurium by thermosonication

SHI Hong-ying，ZHANG Jing-yan，WU Wei-dong，CHEN Chen，LIAO Hong-mei*，DING Zhan-sheng
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Inactivation of Salmonella typhimurium by mild heat and thermosonication at 32～52℃，especially the effect of temperature on inactivation were investigated.Results showed that it did not meet safety standards as suspension exposed to mild heat at 32～52℃，while the log-reduction of S.typhimurium was significantly enhanced by thermosonication at the same temperature.The inactivation of S.typhimurium reaching the level of non-detectable limit were achieved when suspension were under 190W for 40min and under 380，570W for 30min at 52℃，respectively.Mild heat exerted minimal inactivation effects on S.typhimurium during thermosonication treatment at lower temperature（32～47℃），and ultrasound was dominant.At lethal temperature of 52℃，the synergistic effects of ultrasound and mild heat existed，which enhanced inactivation efficacy and rates.

Salmonella typhimurium；thermosonication；inactivation；temperature

TS255.44

A

1002-0306（2015）04-0089-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.010

2014－05－23

施红英（1991-），女，本科，主要从事食品非热加工技术方面的研究。

廖红梅（1983-），女，博士，讲师，主要从事食品非热加工技术方面的研究。

国家自然科学基金项目（31101360）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（JUSRP21125）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。