利胆消黄汤对梗阻性黄疸兔肝细胞线粒体氧化损伤的保护作用

王百林，苑　伟，程海坤，王　蕊，翟淑萍，周海玲

利胆消黄汤对梗阻性黄疸兔肝细胞线粒体氧化损伤的保护作用

王百林1，苑伟2，程海坤1，王蕊1，翟淑萍1，周海玲1

目的：研究利胆消黄汤对梗阻性黄疸兔肝细胞线粒体氧化损伤的保护作用。方法：新西兰白兔30只，随机分为对照组、梗阻性黄疸组和中药组，采用胆总管中段捆扎法制备兔梗阻性黄疸模型；中药组于造模后第7 d开始给予利胆消黄汤灌胃，50 mL/次，1次/d。于造模后第14 d取各组兔肝组织，采用ELISA法和硫代巴比妥酸(TBA)酶比色法分别对肝组织内的8-羟基-2-脱氧鸟苷酸（8-OHdG）和丙二醛（MDA）含量进行检测；并同时取动脉血，检测血清谷草转氨酶（AST）活性和总胆红素（TBIL）含量。结果：梗阻性黄疸组肝组织8-OhdG和MDA含量分别为(1489±262)pg/mgprot、(0.82±0.21)nmol/mgprot，对照组二者的含量分别为(210±78)pg/mgprot、(0.21±0.09)nmol/mgprot，梗阻性黄疸组中8-OhdG和MDA含量高于对照组（P＜0.05）。中药组肝组织8-OhdG和MDA含量分别为(249±212)pg/mgprot、(0.23±0.17)nmol/mgprot，较梗阻性黄疸组明显降低（P＜0.05）。梗阻性黄疸组血清AST和TBIL含量分别为(102.3±32.6)IU/L、(16.3±5.1)μmol/L，较对照组二者的含量[（49.5±9.8）IU/L，（5.4±1.1）μmol/L]升高（P＜0.05）。与梗阻性黄疸组相比，中药组血清AST含量（52.9±12.4）IU/L和TBIL含量（5.6±1.3）μmol/L降低有显著性差异（P＜0.05）。结论：利胆消黄汤对兔肝细胞线粒体内氧化应激所导致的损伤具有修复作用，其机制可能与抑制肝细胞线粒体8-OHdG和MDA生成有关。

梗阻性黄疸；利胆消黄汤；肝细胞；线粒体；兔

梗阻性黄疸常由于某些疾病导致胆汁流出受阻，积聚于肝内，引起肝细胞凋亡和坏死，最终发展成肝纤维化和肝硬化[1]。其发病机制涉及到肝细胞的氧化应激和线粒体功能障碍[2]。中医理论认为，梗阻性黄疸的基本病机是湿浊瘀血阻滞，湿蒸热郁导致黄疸，黄疸进而引起肝细胞损害。利胆消黄汤是通腑泄热法常用方剂，对于梗阻性黄疸具有显著疗效，但对于具体作用机制研究报道尚少。本研究通过检测氧化损伤指标8-羟基-2-脱氧鸟苷酸（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和肝功能指标，探讨利胆消黄汤对肝细胞的保护作用，为中医中药的推广应用提供理论根据。

1　材料与方法

1.1动物健康新西兰白兔30只（广州中医药大学实验动物中心提供），雌雄不限，质量2.5～3.0 kg。饲养于兔间，室温（22±2）℃，湿度50%～70%，自由进食、饮水。

1.2用药利胆消黄汤，以茵陈蒿汤、大柴胡汤加减为主：茵陈20 g，金银花15 g，柴胡15 g，黄芩10 g，栀子10 g，大黄10 g，元胡10 g，郁金10 g，蒲公英10 g，猪苓10 g，泽泻15 g，芒硝5 g。水煎150 mL。

1.3主要试剂和仪器8-OhdG ELISA试剂盒（华美，产品编号：CSB-E16966Rb/Lot:W08012146），MDA检测试剂盒（南京建成，货号A003-1）。北京谱析通用仪器有限责任公司生产的紫外可见光分光光度计（型号Tu-1810 PC）。

1.4兔梗阻性黄疸模型制备术前禁食12 h，禁饮6 h。依次注射阿托品0.01 mg/kg，颅痛定0.3 mL，青霉素40万U后，3%戊巴比妥钠30 mg/kg，耳缘静脉注射麻醉。备皮、消毒，沿上腹正中切口，长约3 cm，开腹后游离胆总管下段，用丝线将胆总管中段扎紧，观察无明显出血渗血，关腹。术后第7 d，再次开腹解除梗阻，恢复胆流。术后14 d，再次取肝组织，进行指标检测。

1.5动物分组、给药及取材将造模兔分为中药组和梗阻性黄疸组,每组12只，非造模兔为对照组6只。中药组于解除梗阻性黄疸后即造模后第7 d开始给予利胆消黄汤灌胃，50 mL/次，1次/d，连续7 d。梗阻性黄疸组给予相同剂量的生理盐水。造模后第14 d分别取各组兔肝组织100 mg，-80℃保存，用于8-OHdG和MDA含量测定；取动脉血检测血清AST活性和TBIL含量。

1.6检测指标及方法

1.6.1肝组织线粒体8-OHdG含量测定称取50 mg组织，置于1 mL预冷的Dounce匀浆器中，按组织线粒体分离试剂盒操作说明分离肝线粒体。用Lowry法测定线粒体浓度。线粒体内8-OHdG含量的检测用兔8-OhdG ELISA试剂盒，具体操作按说明书进行。最后在450 nm处测OD值，通过绘制标准曲线求出标本中8-OHdG的浓度，按pg/mgprot进行统计。

1.6.2肝组织MDA含量检测用MDA检测试剂盒进行检测。具体操作按说明书进行，最后用紫外可见光分光光度计在532 nm测定吸光度。组织中MDA含量=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（10 nmol/mL）÷待测样本蛋白浓度；同时用公式法粗测定样品中蛋白浓度，MDA含量用nmol/mgprot表示。

1.6.3分别用ALCYON160全自动生化分析仪和TBIL试剂盒测定血清AST活性和TBIL含量的测定。

1.7统计学分析实验数据采用SPSS17.0软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示。进行方差齐性检验和t检验，取P＜0.05为差异显著。

2　结果

2.1各组兔肝组织线粒体内8-OHdG和MDA含量变化造模后第14 d，梗阻性黄疸组兔肝组织线粒体8-OHdG和MDA较对照组升高有统计学意义（P＜0.05）；中药组与梗阻性黄疸组比较，肝组织线粒体8-OHdG和MDA含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明中药可以降低肝细胞线粒体内的8-OHdG和MDA含量。见表1。

表1 各组兔肝组织线粒体内8-OHdG和MDA含量变化(±s)

表1 各组兔肝组织线粒体内8-OHdG和MDA含量变化(±s)

注：与对照组比较,aP＞0.05；与梗组性黄疸组比较,bP＜0.05

组别对照组梗阻性黄疸组中药组n　6 1 2 12治疗14 d后8-OHdG(pg/mgprot) 210±78 1489±262a249±212b治疗14 d后MDA(nmol/mgprot) 0.21±0.09 0.82±0.21a0.23±0.17b

2.2各组血清AST和TBIL含量变化造模后第14 d，梗阻性黄疸组兔血清AST活性和TBIL含量较对照组升高有统计学意义（P＜0.05）；中药组与梗阻性黄疸组比较，血清AST活性和TBIL含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明中药可以退黄和改善肝脏功能损害。见表2。

表2　各组兔血清AST活性和TBIL含量变化(±s)

表2　各组兔血清AST活性和TBIL含量变化(±s)

注：与对照组比较,aP＞0.05；与梗组性黄疸组比较,bP＜0.05

组别对照组梗阻性黄疸组中药组n　6 1 2 12治疗14 d后AST(IU/L) 49.5±9.8 102.3±32.6a52.9±12.4b治疗14 d后TBIL(μmol/L) 5.4±1.1 16.3±5.1a5.6±1.3b

3　讨论

线粒体DNA是决定线粒体功能的一个重要因素，若mtDNA发生了损伤，线粒体功能必然受到严重影响[3]。在梗阻性黄疸时，线粒体是肝细胞内最先受损的细胞器。对于梗阻性黄疸大鼠模型研究表明肝损伤与肝线粒体生成减少相关[4]。8-OHdG是最敏感的DNA损害标志物，被公认为是评价细胞DNA氧化损伤和机体氧化应激状态的重要指标之一，研究表明8-OhdG含量与细胞核DNA和mtDNA的损伤程度有关[5]。MDA是脂质发生过氧化反应产生的代谢产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，导致细胞或细胞器结构和功能的改变，具有细胞毒性[6]。细胞内MDA的含量可反应细胞氧化应激的程度，也是反应细胞线粒体功能的主要指标之一。本课题组前期对结扎的兔胆总管梗阻性黄疸模型研究结果表明8-OhdG和MDA参与了梗阻性黄疸肝细胞损伤过程[7]。

中医理论认为，黄疸病证的基本病机是湿浊瘀血阻滞，发黄的关键是湿蒸热郁[8]，黄疸可以引起肝细胞损害。利胆消黄汤是由茵陈蒿汤和大柴胡汤联合加减为主，包括茵陈、大黄、栀子、柴胡、枳实、芍药、半夏、生姜、芒硝、猪苓、泽泻等。其中芒硝含有硫酸钠，由于渗透压的作用能导致泻下，此外还有利胆、消肿、舒张胆总管下端括约肌的作用。合理运用下法，对炎症的消退有积极的作用。半夏、枳实调节胃肠功能。方中猪苓、泽泻是分利小便的代表药物，可促进血液中结合胆红素、尿胆原、尿素氮等物质同水分一起经尿液排出。茵陈蒿汤不仅促进胆红素代谢的作用，还具有抑制肝细胞凋亡、抑制星状细胞活化及胶原合成等作用，其作用的物质基础主要为6，7－二甲氧基香豆素、都桷子素及大黄素等[9]。近年临床以该方随证加减，已广泛用于肝胆系统疾病及药物所致的肝脏损害，特别是对各种黄疸的治疗，显示出有其独特的作用[10-11]。加味大柴胡汤治疗可以减少自由基的产生，减少肝线粒体的损伤，保护肝细胞能量代谢[12-13]。大柴胡汤保肝效果也十分明显，特别是对梗阻性黄疸病症，具有明显的疏肝利胆的效果[14]。大量研究表明此方对于梗阻性黄疸具有显著的疗效，对于其损伤的肝细胞也有一定的修复作用[15]。本研究对梗阻性黄疸组、中药组与对照组治疗前后的AST和TBIL含量进行检测证实，利胆消黄汤能够明显对兔梗阻性黄疸起到退黄和改善肝脏功能损害的作用。

本研究对梗阻性黄疸组、中药组与对照组肝细胞内的8-OHdG和MDA的含量进行检测，梗阻性黄疸组其含量明显高于对照组，证实兔梗阻性黄疸可导致肝细胞线粒体内氧化应激损伤，其损伤机制可能与肝细胞线粒体内8-OHdG和MDA有关。对中药组在解除梗阻后给予利胆消黄汤治疗7 d后，发现兔肝细胞线粒体内8-OHdG和MDA的含量较梗阻性黄疸组降低说明利胆消黄汤对于兔肝细胞线粒体内氧化应激所导致的损伤具有修复作用，其机制可能与抑制肝细胞线粒体8-OHdG和MDA生成有关。

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（收稿：2014-09-26修回：2015-05-20）

（责任编辑张淑坤）

The Protective Effect of Gallbladder Eliminating Jaundice Soup for Rabbit Liver Mitochondrial Oxidative Damaged by Obstructive Jaundice

WANG Bai-lin,YUAN Wei,CHENG hai-kun,et al.Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine Guangzhou(510405),China

ObjectiveTo study the protective effect of Gallbladder eliminating jaundice soup for rabbit liv⁃er mitochondrial oxidative damaged by obstructive jaundice.MethodThirty New Zealand rabbits were divid⁃ed into the control group,the obstructive jaundice group and the traditional Chinese medicine group randomly. The rabbit obstructive jaundice models were established by bundling up middle of the biliary tract.The tradition⁃al Chinese medicine group rabbits were treated with 50 mL gallbladder eliminating jaundice soup once a day by gavages after being modeled for 7 days.According to 14-day time points after being modeled，liver tissue in all groups was taken and the index-8-OhdG and MDA were detected by ELISA method and TBA.Enzyme colorime⁃try and at the same time drawing arterial blood to detect the contents of AST and TBIL to evaluate the liver func⁃tion.ResultThe levels of 8-OhdG and MDA（1489±262）pg/mgprot，（0.82±0.21）nmol/mgprot in the liver tissuse of the obstructive jaundice group were higher than those（210±78）pg/mgprot，（0.21±0.09）nmol/mgprot in the control group（P＜0.05）.The levels of those（249±212）pg/mgprot，（0.23±0.17）nmol/mgprot in the tradi⁃tional Chinese medicine group were lower than those in the obstructive jaundice group with statistically signifi⁃cant differences（P＜0.05）.The ASTand TBIL levels（102.3±32.6）IU/L，（16.3±5.1）μmol/L in the obstructive jaundice group were higher than those（49.5±9.8）IU/L，（5.4±1.1）μmol/L）in the control group（P＜0.05）.Com⁃paring with the obstructive jaundice group,the levels of AST and TBIL（52.9±12.4）IU/L，（5.6±1.3）μmol/L in the traditional Chinese medicine group were lower than those with statistically significant differences（P＜0.05）. ConclusionThe gallbladder eliminating jaundice soup shows a repairing effect on the oxidative dam⁃age of rabbit liver mitochondria about obstructive jaundice,the mechanism may be related to inhibitingthe formation of 8-OHdG and MDA in the liver mitochondria.

Obstructive jaundice;gallbladder eliminating jaundice soup;liver cells;mitochondria;rabbits

Q95-33；R657.4+2

A

1007-6948(2015)04-0373-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.04.011

广东省自然基金项目（S2013010016323）

1.广州中医药大学第一附属医院肝胆外科（广州 510405）

2.广州中医药大学附属祈福医院普外科（广州 511495）

王百林，E-mail:wangbailin888@sina.com